NOTCH1 inhibition regulates evolutionary conserved miRNAs in T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL)

La leucemia acuta linfoblastica di tipo T (LAL-T) è un tumore ematologico aggressivo, risultante dalla trasformazione dei progenitori delle cellule T. Le mutazioni attivanti nel fattore di trascrizione oncogene NOTCH1 attivato dal ligando si trovano in oltre il 60% dei casi della LAL-T. Recentemente, è stato dimostrato che diversi microRNAs cooperano con NOTCH1 nella patogenesi della LAL-T. Tuttavia, attualmente poco è noto sui microRNAs regolati in seguito all'inibizione di NOTCH1. Quindi, in visione di future terapie che potrebbero combinare l'inibizione di NOTCH1 con la terapia basata sui microRNAs, abbiamo intrapreso lo studio sui microRNAs regolati in seguito all'inibizione di NOTCH1 e sul loro ruolo funzionale nella patogenesi della LAL-T. Dapprima, abbiamo generato un modello murino di leucemia indotta da NOTCH1, che porta una mutazione in NOTCH1 frequentemente trovata in pazienti con LAL-T (L1601P-PEST), ed abbiamo inibito la segnalazione di NOTCH1 in vivo trattando animali malati con un potente inibitore della gamma secretasi (DBZ ). Questi campioni di LAL-T indotta da NOTCH1 sono stati sottoposti all’analisi di espressione dei miRNAs utilizzando un mouse array (8X60K release 19.0; Agilent) e, in parallelo, all’analisi di espressione genica utilizzando SurePrint G3 Mouse Gene Expression v2 array (Agilent). I geni a valle di MYC e di NOTCH sono risultati significativamente repressi a seguito dell'inibizione di NOTCH1 grazie alla Gene Set Enriched Analysis (GSEA), che abbiamo trovato il cluster miR-17-92, precedentemente riportato come altamente espresso nei campioni di LAL-T. La loro regolazione è stata confermata anche in un altro modello murino di LAL-T indotta da NOTCH1 e nelle cellule umane di leucemia di tipo T. In particolare, abbiamo identificato i miR-34a-5p, miR-22a-3p e miR-199a-5p per essere significativamente indotti inseguito all'inibizione di NOTCH1 suggerendo un loro presunto ruolo come soppressori del tumore nella leucemia indotta da NOTCH1. Anche se possiamo ipotizzare che questi miRNAs possano svolgere un ruolo importante nella leucemia di tipo T murina, non sono risultati essere espressi nelle cellule di LAL-T umane. Diversamente, il miR-22a-3p risultava significativamente indotto in seguito all'inibizione di NOTCH1 sia nelle cellule di LAL-T murine che umane. Inoltre, la sovra-espressione del miR-22a-3p ha inibito la formazione di colonie in vitro in linee cellulari di LAL-T, che portavano l’attivazione costitutiva di NOTCH1, e ha significativamente ridotto la crescita del tumore in vivo quando sovra-espresso in cellule umane di LAL-T, suggerendo un ruolo come soppressore del tumore per il miR-22 nella LAL-T a valle di NOTCH1. La meta-analisi del dataset umano di LAL-T già pubblicato ha mostrato, tra i gruppi di geni significativamente indotti, i target dei microRNAs appartenenti al cluster miR-17/92. Questi risultati sono in accordo con la nostra analisi di espressione differenziale dei microRNAs murini, in cui abbiamo trovato che i componenti del cluster miR-17/92 sono fortemente repressi. Inoltre, utilizzando lo stesso set di dati umani, abbiamo eseguito una GSEA verso la C3 sottoclasse dei miR targets in MSigDB v6.0, inclusi set di geni aggiuntivi con putativi targets del miR-22. Tra i gruppi di geni repressi, abbiamo identificato 23 geni repressi che contribuivano in modo consistente all'arricchimento negativo di tutti e tre i gruppi di geni selezionati dei bersagli del miR-22. Tra questi geni, abbiamo trovato il Recettore Gamma attivato dal Proliferatore del Perossisoma, Coattivatore 1 Beta (PGC-1β), coinvolto nel metabolismo mitocondriale. In particolare, l'analisi GSEA ha identificato i fattori di trascrizione regolati in modo significativo dopo il trattamento con DBZ in cellule umane di LAL-T, trovando che il set di geni PPARG_01, contenente bersagli del fattore di trascrizione PPARG, era significativamente represso in questo contesto. PGC-1β è risultato significativamente represso in seguito all'inibizione di NOTCH1 in vivo negli xenografts di PDTALL umani e in una delle tre linee cellulari di LAL-T, che sovraesprimono il miR-22, a livello trascrizionale. D'altra parte, la quantità di proteina PGC-1β è risultata essere molto elevata e insensibile all'inibizione di NOTCH1 o alla sovraespressione del miR-22. In conclusione, abbiamo scoperto che il miR-22-3p era represso nelle cellule di LAL-T e il suo livello di espressione poteva essere ripristinato inseguito all'inibizione di NOTCH1. La sovraespressione del miR-22-3p influenzava la crescita tumorale in vivo, probabilmente alterando la migrazione e favorendo così la progressione della malattia, supportando il suo ruolo di soppressore del tumore nelle cellule di LAL-T con NOTCH1 mutato. La meta-analisi dei geni regolati da NOTCH1 nelle linee cellulari umane di LAL-T indicava PGC-1β come un possibile gene bersaglio del miR-22, la cui espressione appariva significativamente regolata solo a livello trascrizionale, mentre a livello proteico risultava inalterata. Pertanto, stiamo ancora studiando il ruolo dell'asse NOTCH1 / hsa-miR-22 / PPARG perché la comprensione del meccanismo d'azione di miR-22-3p nelle cellule di LAL-T potrebbe contribuire al successo del trattamento per la LAL-T, aprendo possibilità di futuri interventi terapeutici che possono combinare l'inibizione di NOTCH1 con la terapia basata su microRNAs.