Colon stem cell characterization in normal and tumoral tissues: description of a novel feed-forward circuit of Msi-1 regulation

I tessuti normali non patologici sono organizzati in una struttura gerarchica all'interno della quale un numero esiguo di cellule origina l'intera totalità della popolazione. Queste cellule presentano longevità, multipotenza, quiescenza e capacità di dividersi in maniera asimmetrica, tutte caratteristiche di staminalità. Abbiamo deciso di sviluppare un sistema in vitro per separare le cellule staminali epiteliali del colon, non basandoci sull'espressione di specifici marcatori di superficie, ma semplicemente traendo vantaggio dal ridotto tasso di proliferazione che queste cellule presentano quando tenute in assenza di siero. Da campioni primari di colon le cellule epiteliali sono state dissociate, marcate con PKH26, che permette l'identificazione di distinte sottopopolazioni basandosi sul tasso di proliferazione, e coltivate in vitro in assenza di siero. Sono stati analizzati i livelli di espressione proteica di CK20, Msi-1 e Lgr5 e di mRNA di alcuni geni associati alla staminalità. L'espressione di questi geni è stata confrontata tra la popolazione cellulare in cultura e tre sottopopolazioni isolate dalle cripte di colon attraverso microdissezione laser. In coltura abbiamo identificato una popolazione PKHpos, in grado di sopravvivere e formare sferoidi, comprendente cellule con un ridotto tasso di proliferazione (PKHhigh) e cellule con rapido tasso (PKHlow). L'analisi citofluorimetrica ha dimostrato che cellule Msi-1+/Lgr5+ si trovano solo nella popolazione PKHhigh, mentre cellule Msi-1+/Lgr5- sono presenti anche nella popolazione PKHlow. Questi risultati sono stati supportati dall'analisi molecolare nelle diverse sottopopolazioni. Nelle cellule Msi-1+/Lgr5+ abbiamo, infatti, riscontrato livelli più alti di espressione di geni associati con la staminalità (Bmi-1, EphB2, EpCAM, ALDH1). Invece l'espressione di citocheratina (CK20) è quasi totalmente ristretta alle cellule PKHlow e PKHneg, le quali esprimono anche Mucin-1 ma non Lgr5. Questi risultati rispecchiano quelli trovati analizzando le popolazioni isolate dalle diverse porzioni delle cripte attraverso microdissezione, e ci hanno permesso di definire una gerarchia di sottopopolazioni cellulari diverse in differenti fasi di maturazione: PKHhigh/Lgr5+/Msi-1+/CK20-, PKHhigh/Lgr5-/Msi-1+/CK20+, PKHlow/Lgr5-/Msi-1+/Ck20-, e PKHlow/ Lgr5-/Msi-1-/ CK20+. Per valutare la presenza di diverse sottopopolazioni con caratteristiche di staminalità anche nel tessuto tumorale, da 5 campioni di tumore primario colorettale e da 15 di metastasi, abbiamo isolato le cellule, marcate con PKH26 e mantenute in assenza di siero. Come per i campioni normali, nei tumori abbiamo identificato una popolazione cellulare poco proliferante e in grado di sopravvivere in vitro in assenza di siero. Invece, nei campioni metastatici non siamo stati in grado di definire chiaramente una popolazione PKHhigh; sembra, infatti, che siano le cellule PKHlow in grado di sopravvivere più a lungo in cultura e quindi selezionarsi. L'analisi citofluorimetrica ha dimostrato che, a differenza dei campioni normali, in quelli metastatici cellule Lgr5+/Msi-1+ non sono presenti solo nella popolazione PKHhigh, ma anche all'interno della sottopopolazione PKHlow. Nelle cellule PKHneg invece non si riscontra l'espressione nè di Lgr5 nè di Msi-1. Entrambe le popolazioni PKHhigh e PKHlow sono state in grado di formare sferoidi e, quando mantenute in presenza del 10% di siero, hanno aderito alle piastre differenziandosi ed assumendo una morfologia epiteliale. Queste cellule perdono conseguentemente l'espressione di Msi-1 e Lgr5 solo dopo 14 giorni in queste condizioni, mentre acquistano l'espressione di CK20. Vista la ridotta presenza di dati inerenti la regolazione di Msi-1, abbiamo infine indagato il possibile coinvolgimento del pathway di Notch sulla regolazione di Msi-1 nelle cellule di tumore del coloretto. Dopo 72 ore di trattamento con il ligando di Notch (DLL4) i livelli di proteina e mRNA di Msi-1 aumentano. Questo fenomeno è bloccato dall'aggiunta di un anticorpo neutralizzante Notch2/3, mentre nessuna variazione è stata riscontrata dopo il trattamento con anti-Notch1. Poiché Msi-1 regola i livelli di Numb, la sua diminuzione comporta un aumento dei livelli proteici di Numb, come riscontrato dall'analisi Western Blot effettuata nei campioni tumorali primari e nella linea cellulare MICOL-14tum. Inoltre, dopo quattro giorni di trattamento, la formazione di sferoidi appare significativamente ridotta dal trattamento con anti-Notch2/3. In conclusione, i nostri dati dimostrano la possibilità di derivare in vitro da campioni di colon normale, senza alcuna strategia selettiva, delle sottopopolazioni in differenti fasi di maturazione. Inoltre, nel tessuto metastatico siamo stati in grado di descrivere un possibile circuito di regolazione che coinvolge Msi-1, Numb, Notch3 e Notch1. In particolare, abbiamo dimostrato che Msi-1 può esser considerato un target di Notch3, e Notch3 può agire come un regolatore positivo di Notch1 attraverso il circuito Msi-1/Numb.