Solution structure determination of two glutaredoxins of trypanosoma brucei

SOMMARIO Le Glutaredosine (Grxs) sono ossidoriduttasi glutatione-dipendenti che appartengono alla super-famiglia strutturalmente caratterizzata dal cosiddetto “Thioredoxin-fold”. A questa famiglia appartengono, oltre alle tioredossine, anche le disolfuro-ossidoriduttasi bisolfuro (DsBs), le glutation-transferasi (GST), le perossiredossine (PRX), le glutation-perossidasi (GPXs) e le nucleoredossine (NRXs). Tutte queste proteine sono enzimi ubiquitari, conservati in tutti i regni viventi, dai virus agli eucarioti e prendono parte a una vasta gamma di processi biologici. Le glutaresossine sono state inizialmente descritte come partner della ribonucleotide reduttasi (Holmgren A., 1976), una proteina essenziale per la biosintesi di deossiribonucleotidi e in seguito è stato dimostrato che esse svolgono un ruolo nella riduzione di deidroascorbato ad ascorbato, nella riattivazione del legame al DNA per alcuni fattori di trascrizione. La GRX1 umana è inoltre fondamentale per la regolamentazione dell'attività di proteasi dell'HIV-1 in vitro. Ultimamente, un numero crescente di articoli pubblicati in letterarura ha messo in luce il ruolo di Grxs nell'omeostasi del ferro cellulare, dimostrandola loro abilità nel costruire, conservare e trasferire cluster ferro zolfo (ISC) di tipo [2Fe2S], suggerendo quindi che le Grxs sono probabilmente coinvolte nell'assemblaggio di metalloproteine e/o agiscono come sensori del ferro (Rouhier et al., 2010). Più in generale,le glutaredossine insieme al tripeptide glutatione (γ-glutamil-cisteinil-glicina) ee alla glutatione-reduttasi, sono note per mantenere lo stato redox intracellulare, proteggendo la cellula da specie reattive dell'ossigeno (ROS) e modulando la reattività di substrati contenenti cisteina, attraverso la formazione o la riduzione di legami disolfuro. Possono essere substrati di questa classe di enzimi sia i ponti disolfuro intramolecolari nelle proteine sia i legami intermolecolari formati dalle cisteine di una proteina con un tiolo a basso peso molecolare (disolfuri misti). Dal punto di vista strutturale, le Grxs sono generalmente piccole proteine globulari (9-14 kDa) caratterizzate da un motivo strutturale altamente conservato (thoredoxin-fold) che nel suo modello più semplice è costituito da un β-foglietto a 4 filamenti circondato da tre α-eliche. Una prima classificazione delle Grxs in sottoclassi è stata fatta sulla base della variabilità del sito attivo e del loro diverso comportamento biochimico (Herrero, E. et al, 2007.): le glutaredoxins classiche hanno in molti casi un sito attivo ditiolico CP(Y/F) C , i anche se sono stati riscontati casi con una sequenza non-canonica C(S/G)(Y/F)C, mentre una seconda classe distinta contiene un sito attivo monotiolico altamente conservato CGFS. Recentemente, l’analisi genomica comparativa ha portato ad un'ulteriore classificazione in sei classi, essendo le prime due classi più importanti (REF):la classe I raccoglie tutte le Grxs a singolo dominiocon sito attivo monotiolico e ditiolico di tipo CPY[C/S], CGYC, CPFC or CSY[C/S], la classe II contiene tutte le glutaredossine con sito attivo altamente conservato CGFS, sia a singolo dominio come proteine di fusione multidominio. È stato tuttavia suggerito che le Grxs a dominio singolo o multiplo dovrebbero essere messe in distinti gruppi funzionali (Hoffmann, BH et al., 2011). Le classi rimanenti sono limitati ad alcuni regni particulari (piante superiori, organismi fotosintetici eucarioti e cianobatteri, rispettivamente). In questo lavoro, la nostra attenzione è stata rivolta a due glutaredossine monotioliche di Trypanosoma brucei, Tb-Grx1 e Tb-Grx3. I tripanosomatidi sono protozoi parassiti del phylum Kinetoplastida e sono noti per essere gli agenti che causano alcune patologie diffuse in tutte le aree tropicali del Sudamerica (malattia di Chagas) e dell’Africa (in particolare la malattia del sonno umana ed una patologia bovina chiamata nagana). I tripanosomi codificano tre glutaredosine monotioliche: Grx1 e Grx2 sono localizzate nei cinetoplasti, i rudimentali mitocondri tipici di protozoi flagellati; la prima è una proteina omodimerica trovata ad una concentrazione fino a 5 M. Grx3 è invece l’unica glutaredossina monotiolica presente nel citosol di questi organismi ed ha la particolarità di essere una proteina di fusione costituita da due domini, in cui una glutatedossina C-terminale è unita mediante una sequenza di dieci residui non conservati ad una tioredoxina N-terminale (Filser, M. et al., 2008). Sia in Grx1 che in Grx3 i siti attivi divergono dal modello tipico conservato, sopra descritto per le glutaredossine monotioliche, il primo è caratterizzato infatti da una sequenza CAYS e il secondo dai residui CGFT. I ruoli biochimici di queste non sono ancora noti, anche se è è da segnalare l'assenza di attività per GRX1 nei comuni test di attività ossidoriduttasica, a differenza di Grx3 che è in grado di ridurre sia l'altro e ponti disolfuro intramolecolari, inoltre. Entrambe le proteine sono in grado di formare in vitro cluster ferro zolfo di tipo [2Fe2S]. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire delle informazioni sulle proprietà biochimiche e più in generale e più in generale sul loro ruolo nel metabolismo redox e sul metabolismo del ferro nei Tripanosomatidi attraverso lo studio mediante NMR della struttura e dinamica in soluzione di questi due enzimi. Inoltre, poiché è stato dimostrato che la Tb-Grx1 è fondamentale per la sopravvivenza del parassita (Manta, B. et al., comunicazione personale), le informazioni strutturali ottenute possono essere utili per sviluppo di nuovi farmaci destinati ii alle malattie menzionate in precedenza. Infine, per la loro peculiarità di essere rispettivamente un omodimero ed una proteina di fusione a due domini, gli studi strutturali su Tb-Grx1 e Tb-Grx3 possono essere utili per la classificazione delle glutaredossine sulla base della loro reattività, la loro terziario e, se presente, struttura quaternaria. Ad oggi (gennaio 2012), ci sono solo sei strutture identificate come glutaredossine monotioliche depositate nel Protein Data Bank, e tutte sono relative aproteine a proteine a singolo dominio e monomeriche. Per realizzare questi obiettivi, sono state messe a punto dellestrategie ottimali per tenere conto delle caratteristiche supramolecolare unica di Tb-GRX1 e Tb-Grx3. Dal momento che la determinazione della struttura di un omodimero in soluzione può essere molto complessa, una prima semplificazione, supportata da esperimenti biochimici (Manta et al, inedito) è consistita sullo studio della parte globulare della proteina Grx1, separata dal suo putativo dominio di dimerizzazione.La struttura della parte globulare di Grx1 è stata risolta con il metodo di classico sfruttando l’effetto nucleare Overhauser (NOE) per ottenere una serie didistanze tra coppie di atomi di idrogeno. Per fare ciò è stato necessario per ottenere la proteina isotopicamente marcata con 13C e 15N al fine di poter acquisire gli esperimenti NMR multidimensionali per realizzare l’assegnazione sequenziale delle frequenze di risonanza degli atomi in catena principale e nelle catele laterali. Per raggiungere questo scopo sono state utilizzate le tradizionali sequenze eteronucleari 3D implementate tuttavia in modalità TROSY (Pervushin, K., et al, 1997) e BEST (Lescop, E. et al., 2007) , per migliorare la risoluzione spettrale e la sensibilità, ma riducendo al minimo il tempo di acquisizione. Le risonanze delle catene laterali ed i vincoli di distanza NOE utilizzati dal software Cyana (Herrmann, T. et al., 2002a e 2002b) per il calcolo della struttura sono stati ottenuti rispettivamente mediante esperimenti 3D-TOCSY e 3D-NOESY. Il putativo dominio di dimerizzazione, composto di 28 aminoacidi, è stato invece ottenuto attraverso sintesi chimica e studiato preliminarmente tramite dicroismo circolare. Per verificare una sua possibile interazione con il dominio globulare di Grx1 sono stati eseguiti eseperimenti di tipo 2D HSQC sulla proteina marcata con 15N, assenza ed in presenza del peptide stesso. Tb-Grx3 al contrario consiste in una proteina di 24kDa composta da due domini, e per questo motivo risulta inadatta per una determinazione strutturale standard via NMR. : vincoli di distanza basati sull'effetto NOE dell'ordine dei 1-5A sono sia ostici da ottenere in un numero rilevante, a causa del fatto che all'aumentare delle dimensioni molecolari aumenta significativamente il numero dei segnali, sia inefficienti nel determinare la mutua orientazione tra i domini, ammesso che non vi siano dinamiche interne che coinvolgono le due parti. iii Per questa ragione abbiamo sviluppato un metodo per calcolare strutture ragionevoli a bassa risoluzione che sfruttano pochi vincoli sperimentali facili da acquisire, quali gli angoli diedri ricavabili dai chemical shifts del backbone e i residual dipolar couplings che danno informazione sulla mutua oorientazione di coppie di atomi, e ch eper questo motivo sono il metodo d'elezione per studi di questo genere. In particolare, la procedura completa è composta da un primo step in cui i due domini vengono ricavati per mezzo di homology modeling e successivamente soggetti a refinement con i dati sperimentali a disposizione (Chou et al., 2000) seguito da una fase di docking (Schwieters et al., 2010) guidato dagli RDC e dall'analisi della curva di Small Angle X-ray Scattering, in modo tale da garantire sia una corretta orientatazione che la compattezza della molecola