Mouse amniotic fluid stem cells are able to differentiate into satellite cells replenishing the depauperated muscle stem cell niche

Introduzione: Negli ultimi anni lo studio delle cellule staminali ha suscitato molto interesse, sia per il grande potenziale di queste cellule nelle terapie e applicazioni cliniche, sia come modello di studio in vitro per diversi tipi di malattie. In particolare, le cellule staminali embrionali hanno una elevata capacità proliferativa e di differenziazione, ma il loro utilizzo è ancora associato a problematiche etiche. Anche le cellule staminali adulte possiedono grandi potenzialità differenziative sia in vitro che in vivo, tuttavia il loro utilizzo è limitato in quanto difficili da isolare ed espandere, soprattutto in ambito clinico. In questo scenario sarebbe vantaggioso poter ottenere una popolazione di cellule con elevata capacità di proliferazione e differenziazione, senza dover affrontare però problemi di tipo etico. Nel 2007 il nostro gruppo ha isolato una popolazione di cellule staminali dal liquido amniotico (cellule AFS), utilizzando come marcatore il recettore c-Kit. Queste cellule hanno capacità clonogenica e possono essere dirette a differenziare in una vasta gamma di tipi cellulari appartenenti a tutti e tre i foglietti germinativi. Obiettivo: Questo lavoro mira a caratterizzare il potenziale miogenico delle cellule staminali del liquido amniotico di topo utilizzando un modello murino di atrofia spinale muscolare. In particolare è volto ad analizzare la capacità delle cellule AFS di dare origine a cellule staminali muscolari e colonizzare la nicchia staminale del muscolo scheletrico. Materiali e Metodi: Le cellule AFS sono state ottenute mediante amniocentesi e selezionate per la positività al marcatore c-kit con metodo immmunomagnetico. Appena isolate le cellule AFS sono state analizzate per l'espressione di diversi marcatori (CD90, CD45, CD44, CD34, CD31, Flk1, SCA1, CD105) tramite citometria a flusso; inoltre, attraverso qRT-PCR è stata analizzata l'espressione di Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 e Sca-1 delle cellule AFS isolate a diversi stadi embrionali. Per la terapia di topi transgenici HSA-Cre, SmnF7/F7, le cellule AFS GFP+ sono state iniettate per via sistemica attraverso la vena caudale; gli animali sono stati poi sacrificati a uno e a quindici mesi dopo il trapianto. Sono stati osservati e analizzati alcuni parametri clinici per valutare l’effetto del trapianto cellulare. Diversi muscoli sono stati raccolti ed analizzati con ematossilina e eosina, tricromica di Masson e mediante immunofluorescenza con anticorpi anti-GFP e anti-distrofina. Per dimostrare la capacità delle cellule AFS di colonizzare la nicchia staminale del muscolo, sono state eseguite delle immunofluorescenze per i marcatori specifici delle cellule satelliti e sono stati eseguiti dei trapianti secondari. Il potenziale miogenico delle cellule AFS è stato valutato anche con trapianto dopo espansione in vitro. Risultati: Il numero medio di cellule AFS presenti nel liquido amniotico varia nel corso della gestazione murina; all’età di 12.5 giorni queste cellule sono circa l’1% del totale ed esprimono marcatori ematopoietici (CD45, CD34, SCA1), marcatori mesenchimali (CD90, CD105) unitamente a Flk1, CD31 e CD44. L’analisi di espressione genica ha dimostrato che le cellule AFS esprimono a bassi livelli Oct4 e Sox2 e alti livelli di c-Myc e Klf4, mentre, nonostante la composizione mista di questa popolazione, non è stata rilevata espressione di marcatori o fattori di trascrizione tipici dei precursori muscolari. I topi HSA-Cre, SmnF7/F7 mediamente muoiono all'età di 10 mesi e durante il corso della loro vita mostrano evidenti complicazioni cliniche come una pronunciata cifosi e atrofia a livello muscolare. Dopo il trapianto con cellule AFS GFP+ o con cellule del midollo osseo, il tasso di sopravvivenza di questi animali aumenta rispettivamente del 75% e 50%. Gli animali trattati con cellule AFS hanno recuperato più del 75% della forza rispetto agli animali non trattati. Un mese dopo il trapianto, i muscoli di topi trattati con cellule AFS presentano il 37% di fibre GFP+, un numero molto basso di miofibre rigeneranti (< 1%) ed una normale espressione di distrofina. Quindici mesi dopo il trapianto, gli animali trattati con cellule del midollo osseo mostrano un elevato numero di fibre centro nucleate, un’importante infiltrazione di tessuto interstiziale e nessuna miofibra GFP+, mentre i topi trattati con cellule AFS hanno un fenotipo molto simile a quello di topi sani della stessa età, e il 58% delle miofibre è GFP+. Risultati simili sono stati ottenuti trattando lo stesso modello animale con cellule AFS dopo espansione in cultura. Discussione: Le cellule AFS isolate dal liquido amniotico di topo sono una popolazione eterogenea; queste cellule esprimono marcatori mesenchimali, ematopoietici e marcatori endoteliali. Va evidenziato che, nonostante la composizione mista di questa popolazione staminale, non esistono precursori muscolari al suo interno, e quindi qualunque differenziamento in senso muscolare di queste cellule è dovuto ad una differenziazione delle cellule AFS e non ad una maturazione di cellule già pre-commited. Quando vengono iniettate in un modello di atrofia muscolare, le cellule AFS mostrano un grande potenziale miogenico, anche a lungo termine, dimostrandosi una interessante fonte cellulare per scopi terapeutici. Queste cellule infatti sono state in grado di differenziare in cellule satelliti localizzandosi nella nicchia delle cellule staminali muscolari ed esprimendo Pax7, a7integrina e SM/c-2.6, tutti marcatori esclusivi delle cellule satelliti. Inoltre, le cellule AFS possono contribuire alla formazione di nuove miofibre anche dopo espansione in cultura, aumentando così lo spettro di possibili applicazioni terapeutiche.