Analysis of the molecular and phenotypic effects mediated by brain tumour microenvironment on glioblastoma derived cells through in vitro and in vivo models.

Il Gliobalstoma multiforme (GBM) è il più comune dei tumori cerebrali nell’adulto, con una prognosi ancora oggi particolarmente infausta e senza trattamenti efficaci. Una delle grosse sfide da affrontare nella ricerca sui tumori cerebrali è la possibilità di riprogrammare queste cellule verso un fenotipo meno aggressivo. Per raggiungere questo scopo tuttavia è necessaria una più ampia e completa conoscenza della biologia di questo tumore, in particolare del ruolo dell’ipossia come regolatore delle principali pathways coinvolte nel modulare il fenotipo delle cellule di GBM. Nella ricerca di nuovi approcci terapeutici, le Bone Morphogenetics proteins (BMPs) si sono dimostrate efficaci nell’indurre un differenziamento astrogliale delle cellule di GBM in vitro. Il pathway di mTOR rappresenta un collegamento controverso fra il mantenimento della staminalità, mediato dall’ipossia, e il differenziamento mediato dal BMP pathway. Infatti l’Hypoxia Inducible Factor-1α (HIF-1α) è controllato a livello trascrizionale e traduzionale dalla proteina mTOR e, come il BMP, lo stesso mTOR pathway modula il differenziamento gliale delle staminali neurali nel sistema nervoso centrale. In questo studio abbiamo valutato il ruolo del pathway di mTOR nel regolare la stabilità di HIF- 1α in cellule primarie derivate da GBM e mantenute in ipossia (2% O2). Abbiamo dimostrato che, quando esposte ad alte tensioni di ossigeno (20% O2), le cellule di GBM attivano il pathway di Akt/mTOR e che la somministrazione del BMP2 promuove effetti analoghi. In particolare, abbiamo dimostrato che HIF-1α reprime il pathway di Akt/mTOR attraverso la up-regolazione della proteina Redd1, inibitore di mTOR. In maniera opposta, BMP2 contrasta la stabilità di HIF-1α modulando I livelli intracellulari di succinato e controllando i livelli di proline hydroxylase 2 (PHD2), 6 attraverso l’inibizione di FKBP38, una proteina regolatoria della PHD2. nonostante siano incoraggianti, questi dati suggeriscono che l’ipossia, caratteristica della nicchia dei tumori cerebrali, contrasta fortemente gli effetti del BMP2; quindi un approccio terapeutico in grado di arrestare la crescita tumorale anche nel suo microambiente ipossico è fondamentale. Nella seconda parte dello studio, l’intento è stato quello di riprogrammare cellule primarie derivate da GBM verso un fenotipo più differenziato e meno aggressivo attivando il Wnt pathway nel loro microambiente ipossico, solitamente correlato con la malignità delle cellule tumorali. Abbiamo dimostrato che la somministrazione esogena del ligando Wnt3a media il differenziamento neuronale e l’inibizione della proliferazione nelle cellule di GBM e che questo fenomeno è più forte in condizioni ipossiche grazie ad una up-regolazione dei co-fattori della β-catenina TCF1 and LEF1. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attivazione del Wnt pathway inibisce il segnale intracellulare di Notch, incrementando gli effetti pro-differenziativi del Wnt che attiva per-se i geni pro-neuronali NEUROD1 e NEUROG1. In particolare, questi effetti si esplicano nella sottopopolazione cellulare tumorale staminale (CD133+). Per valutare gli effetti dell’attivazione di questa pathway in vivo abbiamo messo a punto un protocollo di xeno-trapianto ortotopico di cellule primarie derivate da GBM in larve di Zebrafish (Danio Rerio). Le evidenze ci dimostrano che l’attivazione del Wnt pathway è in grado di promuovere il differenziamento neuronale delle cellule di GBM e di inibire il Notch pathway anche nel contesto di un modello animale. Conclusione: in questo studio abbiamo delucidato i meccanismi molecolari attraverso cui due stimoli pro-differenziativi, BMP2 e osiigeno, controllino la stabilità di HIF-1α. Abbiamo riportato in precedenti lavori che entrambi questi stimoli inducono il differenziamento astro gliale e bloccano la crescita delle cellule di GBM. Abbiamo inoltre evidenziato le differenze tra cellule tumorali di GBM e cellule staminali neurali sane nella risposta agli stimoli pro-differenziativi, divergenze di risposta che richiedono ulteriori indagini per meglio definire la biologia del tumore. Inoltre, abbiamo delucidato la relazione epistatica che intercorre tra HIF-1α, Wnt e Notch in cellule derivade da glioblastoma, dimostrando come Wnt regoli la soppressione del Notch pathway nel microambiente ipossico dei glioblastomi. 7 La terza parte del mio progetto di dottorato si è focalizzata su un tumore cerebellare pediatrico di origine neuronale classificato come Medulloblastoma (MDB), che si riscontra essere il più frequente fra i tumori cerebrali pediatrici. Le più recenti ricerche rivelano che il MDB deriva da cellule staminali del cervelletto che proliferano in maniera aberrante perdendo il controllo della loro capacità di auto-rinnovamento. E’ stato inoltre riportato che cellule di MDB hanno una elevata attivazione endogena del Notch signalling, noto per promuovere proliferazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali neoplastiche e per inibire il loro differenziamento. Se l’interazione fra HIF-1α e il Notch signalling ha la funzione di mantenere i precursori neurali sani in uno stato indifferenziato, la loro interazione nelle cellule di MDB non è ancora stata caratterizzata. In questo studio abbiamo analizzato se l’ipossia, stabilizzando HIF-1α, modulasse il signalling di Notch1 in cellule primarie derivate da MDB. I nostri risultati indicano che cellule staminali derivate da MDB richiedono un ambiente ipossico per la loro espansione in vitro, mentre un’esposizione acuta delle stesse al 20% di ossigeno induce il differenziamento delle cellule tumorali e la loro morte attraverso l’inibizione del Notch1. Da notare che attivando Notch1 con il suo ligando DLL4 in condizioni ipossiche si ha un’espansione di precursori CD133+ e Nestina+ del MDB, suggerendo un effetto regolatorio di questo pathway sulla sotto-popolazione staminale. Al contrario, cellule di MDB vanno incontro a differenziamento neuronale quando trattate con un inibitore della γ-secretase che previene l’attivazione del Notch. Conclusione: Questi risultati suggeriscono che l’ipossia, attivando il signalling intracellulare di Notch, preserva le cellule staminali di MDB e ne promuove l’espansione. Significato: Con questo lavoro abbiamo cercato di definire la complessa regolazione che modula il fenotipo delle cellule staminali tumorali e abbiamo contribuito a chiarire la interrelazione fra i diversi signalling pathway che controllano fenotipo e comportamento delle cellule derivate da tumore cerebrale.