Structural characterization of Helicobacter pylori proteins contributing to stomach colonization

Helicobacter pylori è un microorganismo patogeno ben caratterizzato, che colonizza lo stomaco di più di metà della popolazione mondiale. È un batterio Gram-negativo, microaerofilo, flagellato, spiraliforme, in grado di instaurare un’infezione cronica della mucosa gastrica, che può durare tutta la vita se non trattata. L’infezione da H. pylori è generalmente acquisita in età infantile, con un tasso di prevalenza maggiore nei paesi in via di sviluppo, e tipicamente persiste per tutto il corso della vita. Come nel caso di molte infezioni croniche, la maggior parte degli individui risulta asintomatica, mentre solo una limitata porzione sviluppa patologie correlate. H. pylori è considerato un microorganismo patogeno poiché causa universalmente un’infiammazione progressiva e danni tissutali alla mucosa gastrica; nello specifico, nel 1994 H. pylori è stato dichiarato un agente carcinogeno di classe I per l’uomo da parte della World Health Organization (WHO). Gli esiti clinici conseguenti all’infezione da H. pylori comprendono patologie gastrointestinali particolarmente severe, quali ulcere peptica e duodenale, adenocarcinoma gastrico non cardia e MALT linfoma (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma). Da più di 100 anni è riconosciuto che la gastrite atrofica è strettamente associata al cancro del tessuto gastrico. La scoperta dell’esistenza di H. pylori nel 1983 ha identificato la causa dell’infiammazione cronica della mucosa gastrica e quindi la causa fondamentale del cancro allo stomaco. Di conseguenza, sin dalla sua scoperta a partire da biopsie di tessuto gastrico, H. pylori è al centro di intense investigazioni e suscita l’interesse di molti studiosi, quali batteriologi, biologi molecolari, gastroenterologi, infettivologhi, biologi specializzati in patologie cancerose, epidemiologi, patologi e farmacologi. Per sopravvivere nell’ambiente estremamente inospitale dello stomaco e potervi realizzare una colonizzazione efficace, H. pylori ha sviluppato una sorprendente macchina molecolare. Poiché non è un batterio acidofilo, H. pylori ha evoluto molti espedienti specializzati per sopravvivere all’acidità gastrica. Innanzitutto, il patogeno deve resistere alle condizioni estreme del lume gastrico solo per un breve periodo, sufficiente per penetrare nella mucosa altamente viscosa, raggiungere l’epitelio gastrico, recuperare nutrienti e moltiplicarsi. Alcuni dei meccanismi coinvolti nell’adattamento alle condizioni acide prevedono il canale per l’urea, UreI, localizzato nella membrana interna e attivato da un pH acido, l’ureasi citoplasmatica, caratterizzata da un optimum di attività a pH neutro, e due anidrasi carboniche, localizzate nel citoplasma e nel periplasma. Questo sistema di adattamento all’acidità gastrica permette di regolare il pH del periplasma e anche del liquido circostante nonostante l’ambiente acido, a livelli compatibili con la sopravvivenza e la crescita. Inoltre, un fattore cruciale per la sopravvivenza e una colonizzazione efficace del tessuto gastrico è rappresentato dalla motilità del batterio, resa possibile da flagelli unipolari e rivestiti da una guaina di difesa; grazie a quali H. pylori è in grado di nuotare in risposta a un gradiente di pH e di rimanere all’interno dello strato di muco gastrico, dove il pH è generalmente maggiore rispetto al lume dello stomaco. Circa solo il 20% dei microorganismi nello stomaco aderisce alla superfice delle cellule epiteliali gastriche; in particolare, l’adesione batterica vede coinvolte interazioni molecolari specializzate, mediate da adesine e altre componenti della superficie batterica, che sono in grado di eludere il riconoscimento da parte del sistema immunitario dell’ospite grazie a una elevata variabilità antigenica. Infatti, H. pylori è caratterizzato da una sorprendente variabilità genetica, non solo per quanto riguarda la sequenza dei geni, ma anche nel contenuto genico; la disponibilità delle sequenze genomiche complete ha reso possibile rilevare questa elevata variabilità in H. pylori. Soprattutto, una delle differenze più evidenti tra i ceppi di H. pylori è la presenza o meno di un frammento di DNA cromosomico di 40 kb chiamato isola di patogenicità cag, che codifica per un sistema di secrezione di tipo IV, responsabile della traslocazione della tossina CagA, uno dei più importanti fattori di virulenza di H. pylori. In seguito all’iniezione all’interno delle cellule epiteliali gastriche, CagA induce una serie di modificazioni cellulari, tra le quali alterazioni della struttura cellulare, della motilità, della proliferazione e della migrazione cellulari, della struttura delle giunzioni cellulari occludenti. Un ulteriore importante fattore di virulenza è la citotossina vacuolizzante VacA, che consiste in una tossina secreta, in grado di formare pori nelle membrane e indurre vacuolizzazione nelle cellule epiteliali gastriche. Quasi tutti i ceppi di H. pylori contengono il gene che codifica VacA, ma la sequenza genica è altamente variabile, causando perciò cambiamenti nell’intensità dell’attività di VacA. Perciò, in base alla variabilità dei fattori di virulenza, i ceppi di H. pylori possono essere classificati in sottotipi, ciascuno dei quali è associato a differenti livelli di patogenicità in seguito a colonizzazione. Oltre a quanto riportato, gli esiti clinici vari e divergenti derivanti dall’infezione da H. pylori dipendono da un intricato bilancio tra variabilità genetica dell’ospite, fattori di virulenza batterica e componenti ambientali. Perciò, la comprensione dettagliata della relazione tra ospite e patogeno è una sfida complessa, ancora da chiarire nella sua interezza. Nonostante che il genoma da più ceppi di H. pylori sia stato completamente sequenziato, molti dei meccanismi di patogenicità non sono ancora stati definiti. Inoltre, l’attuale trattamento di eradicazione di H. pylori prevede una tripla terapia che combina un inibitore di pompa protonica e due antibiotici; ma la crescente diffusione di antibiotico resistenza è il principale motivo del fallimento di questa terapia. Perciò si rende necessario identificare nuovi target farmacologici contro questo patogeno, al fine di superare il preoccupante problema della farmaco resistenza e di sviluppare nuovi trattamenti antibiotici. Lo scopo principale di questo progetto di ricerca verte sull’identificazione e la caratterizzazione strutturale di nuovi potenziali target farmacologici di H. pylori. A questo proposito, proteine responsabili di colonizzazione e virulenza, così come proteine secrete che mediano le rilevanti interazioni tra ospite e patogeno, sono ritenute interessanti candidati per la caratterizzazione strutturale, allo scopo di approfondire la loro funzione presunta. In dettaglio, le indagini di questo progetto di ricerca si sono concentrate sull’α-anidrasi carbonica (HPG27_1129), con localizzazione periplasmatica, la β-anidrasi carbonica (HPG27_4), con localizzazione citoplasmatica, la proteina flagellare FliK (HPG27_857), l’ossidoreduttasi HPG27_1020 e infine due “proteine ipotetiche” secrete, di funzione sconosciuta, cioè HPG27_1030 e HPG27_1117. Il lavoro di ricerca descritto in questa tesi è stato eseguito presso il Dipartimento di Scienze Biomediche dell’Università di Padova e presso l’Istituto Veneto di Medicina Molecolare (VIMM) di Padova. La strategia adottata prevedeva analisi bioinformatiche preliminari, amplificazione del gene di interesse tramite PCR a partire da DNA cromosomico purificato di H. pylori (ceppo G27), clonaggio in vettori in fusione con un 6-His-tag ed espressione in cellule competenti di E. coli. Di seguito, Le proteine ricombinanti sono state purificate tramite procedimenti che prevedono due passaggi cromatografici, sia dalla frazione solubile che da quella insolubile, e quindi concentrate per le prove di cristallizzazione. α-anidrasi carbonica è stata cristallizzata con successo e la struttura è stata determinata tramite diffrazione a raggi X. Inoltre, sono stati ottenuti cristalli anche di β-anidrasi carbonica e di HPG27_1117, però non adatti per la misura di dati di diffrazione a raggi X di buona risoluzione. Per assicurare la qualità del campione di proteina, sono state eseguite analisi quali Western blotting, gel-filtrazione analitica, spettro di assorbimento UV-Vis, spettro di dicroismo circolare. Le peculiarità strutturali e le possibili implicazioni funzionali di α-anidrasi carbonica sono descritte nel Capitolo III. Questa proteina periplasmatica svolge un ruolo chiave nell’intricato bilancio di urea e bicarbonato volto alla sopravvivenza del batterio nello stomaco, poiché catalizza la conversione reversibile dell’anidride carbonica in bicarbonato; perciò, essa è fondamentale nel regolare il pH del periplasma, dove è localizzata. α-anidrasi carbonica da H. pylori è stata clonata come proteina ricombinante mancante del segnale N-terminale di secrezione, è stata espressa in cellule di E. coli e infine purificata; cristalli sono stati ottenuti mediante il metodo a diffusione di vapore e la struttura è stata determinata a 1.52 Å tramite molecular replacement, basandosi su un modello costruito a partire da α-anidrasi carbonica di Sulfurihydrogenibium yellowstonense (Di Fiore et al., 2013; codice PDB: 4G7A). La struttura della proteina condivide molte caratteristiche con altri membri della famiglia delle α-anidrasi carboniche, in quanto presenta un β-foglietto centrale costituito da 10 filamenti, circondato da 3 α-eliche e dalla rimanente catena polipeptidica. Alcune peculiarità strutturali sono presentate dal sito attivo, poiché il residuo di acido glutammico (posizione 127) che interagisce con i tre residui catalitici di istidina è sostituito da un residuo si serina nella stessa posizione e la carica negativa mancante è rimpiazzata da uno ione cloro catturato dal mezzo esterno. La determinazione dei dettagli strutturali di questa proteina permette di ricercare nuovi specifici inibitori che possano agire come potenziali antibiotici contro H. pylori. Inoltre, sono state eseguite delle prove di cocristallizzazione con inibitori sulfamidici, per investigare i dettagli strutturali delle interazioni dei composti inibitori col sito attivo; ma cocristalli di qualità adatta per la misura dei dati di diffrazione a raggi X non sono stati ancora ottenuti. Il microorganismo patogeno codifica anche un’ulteriore anidrasi carbonica, cioè β-anidrasi carbonica localizzata nel citoplasma, le cui indagini sono descritte nel Capitolo IV. Si ipotizza che questo enzima catalizzi la stessa conversione per quanto riguarda le molecole di anidride carbonica che non diffondono liberamente al di fuori della membrana interna; perciò contribuisce alla regolazione del pH del citoplasma e alla sopravvivenza nell’ambiente gastrico estremamente acido. β-anidrasi carbonica è stata clonata come proteina ricombinante con un 6-His-tag ed espressa in cellule competenti di E. coli; però il principale limite incontrato è stato una limitata resa di proteina solubile, probabilmente dovuta a un’impropria organizzazione tridimensionale da parte delle cellule di E. coli. La purificazione è stata eseguita sia a partire dalla frazione solubile sia da quella insolubile, adottando tecniche cromatografiche variegate. Il campione di proteina di migliore qualità è stato ottenuto per mezzo della cromatografia di affinità per ioni metallici immobilizzati, sebbene la resa finale di proteina purificata sia stata compromessa a causa della moderata affinità per la resina Ni-NTA. La proteina purificata è stata concentrata per le prove di cristallizzazione, ma i cristalli ottenuti non sono di qualità adatta per la misura dei dati di diffrazione a raggi X. Nel Capitolo V è riportato il lavoro di ricerca sulla proteina flagellare FliK. Come menzionato in precedenza, la motilità batterica mediata dai flagelli unipolari è un fattore essenziale per minimizzare il contatto con l’ambiente acido e realizzare una colonizzazione efficiente della mucosa gastrica. In H. pylori si prevede che più di 50 proteine siano coinvolte nell’espressione, secrezione e assemblaggio dell’apparato flagellare. Quest’ultimo è composto di tre elementi strutturali; un corpo basale, un filamento esterno a forma elicoidale e un uncino che serve ad unione. FliK è responsabile del controllo della lunghezza dell’uncino e si è osservato che in mutanti mancanti del gene di FliK si formano lunghi uncini di lunghezza incontrollata, chiamati “polyhooks”, che compromettono la motilità batterica. Analisi bioinformatiche preliminari hanno evidenziato come questa proteina flagellare presenti una struttura globale altamente disordinata, con una limitata regione strutturata localizzata a livello del dominio C-terminale. FliK è stata clonata come proteina ricombinante con un 6-His-tag e numerosi tentativi di espressione sono stati eseguiti, facendo uso di differenti ceppi di E. coli e variando le condizioni. Nonostante ciò, si sono riscontrati un’impropria produzione di FliK da parte delle cellule di E. coli e un’evidente degradazione della proteina, probabilmente entrambi gli eventi dovuti all’elevato grado di disordine della sequenza amminoacidica. Alcune strategie per risolvere questo limite dell’espressione potrebbero essere il clonaggio dei singoli domini oppure l’utilizzo di sistemi di espressione più sofisticati, in grado di strutturare correttamente la proteina. Poiché la formazione dei ponti disolfuro riveste un ruolo chiave anche nella virulenza batterica, molti batteri posseggono sistemi molecolari per l’assemblaggio delle proteine nel corretto stato ossidativo, tra cui anche H. pylori. L’ossidoreduttasi HPG27_1020, le cui procedure sperimentali sono riportate in Capitolo VI, è una proteina con un’organizzazione simile alla tioredoxina che riveste un ruolo cruciale nella maturazione del citocromo c, così come nell’assemblaggio corretto di proteine ossidate. Perciò, questa proteina fornisce funzioni essenziali per H. pylori e rappresenta un possibile target farmacologico. Poiché la regione N-terminale codifica un segnale di secrezione, la proteina è stata clonata come proteina ricombinante con un 6-His-tag e mancante dei 24 amminoacidi N-terminali. HPG27_1020 ricombinante è stata espressa con successo in cellule di E. coli, mostrando una quantità significativa di proteina nella frazione solubile (circa il 60%). Però le ricerche sono state obbligatoriamente interrotte, in quanto nel frattempo è stata determinata e pubblicata la struttura dell’ossidoreduttasi da H. pylori 26695, cioè HP0377. Poiché la loro sequenza amminoacidica presenta un elevato grado di identità (96%), le indagini sono state considerate non più innovative. Nel Capitolo VII sono descritti il clonaggio, l’espressione, la purificazione e le prove di cristallizzazione per quanto riguarda due “proteine ipotetiche” secrete, cioè HPG27_1030 e HPG27_1117. Recentemente numerose proteine secrete sono state identificate tramite analisi proteomica del secretoma di H. pylori; queste rappresentano interessanti soggetti di indagini strutturali e funzionali, poiché potrebbero mediare importanti interazioni tra ospite e patogeno e, quindi, concorrere come potenziali target per lo sviluppo di antibiotici e vaccini. HPG27_1030 è stata clonata con successo come proteina ricombinante con un 6-His-tag, espressa in cellule di E. coli e purificata tramite due passaggi cromatografici. È stato possibile ottenere una quantità molti rilevante di proteina solubile, questa ha esibito un’elevata instabilità in soluzione e una chiara tendenza all’aggregazione, portando perciò a una limitata concentrazione finale di campione purificato per le prove di cristallizzazione. HPG27_1117 è stata clonata, espressa e purificata come riportato sopra. I limiti più rilevanti che sono stati incontrati sono una bassa resa di espressione e la tendenza alla degradazione del campione. Nonostante ciò, la proteina purificata è stata concentrata per le prove di cristallizzazione e sono stati ottenuti cristalli utilizzando il metodo di diffusione di vapore; ma questi hanno diffranto ad una risoluzione troppo limitata e non è stato possibile ottenere cristalli di qualità adatta per le misure di diffrazione a raggi X. Per superare il problema comune dell’instabilità e della degradazione di queste proteine secrete, cambiamenti nella composizione dei tamponi di purificazione potrebbe migliorare la stabilità in soluzioni e così la resa finale di prodotto purificato per le prove di cristallizzazione. In conclusione, grazie all’individuazione di alcune nuove peculiarità di questo patogeno è stato possibile accrescere la conoscenza in merito a H. pylori e i suoi meccanismi peculiari volti alla sopravvivenza e alla virulenza. Questi primi risultati costituiscono la base per nuove investigazioni, al fine di apprendere nel modo più completo possibile i meccanismi patofisiologici di questo peculiare microorganismo e di sviluppare nuovi trattamenti per l’eradicazione.