Mechanism of activation and function of the odorant receptor expressed at the axon terminus-growth cone of olfactory sensory neurons

Una caratteristica peculiare dell’organizzazione topografica del bulbo olfattivo è il “duplice ruolo” del recettore olfattivo. Esso non solo è in grado di riconoscere gli odori, ma sembra anche svolgere un ruolo chiave nella convergenza assonale dei neuroni sensoriali olfattivi a formare i glomeruli in specifiche posizioni nel bulbo olfattivo. Questa segregazione spaziale delle afferenze assonali porta alla formazione della mappa sensoriale. Un ruolo del recettore olfattivo nei processi di “axon guidance” (orientamento assonale) è stato suggerito da esperimenti genetici (Wang et al., 1998) e successivamente confermato da studi che hanno rivelato la presenza del recettore olfattivo a livello della porzione distale dell’assone e nel cono di crescita (Barnea et al., 2004, Strotmann et al., 2004). La questione che rimane da affrontare è se il recettore olfattivo espresso al cono di crescita sia funzionale e se si, quale sia la cascata di segnalazione intracellulare accoppiata alla sua attivazione. In uno studio precedente, Maritan et al. (2009), hanno dimostrato, per la prima volta, che il recettore olfattivo espresso al cono di crescita è funzionale ed associato a locali incrementi di cAMP e Ca2+. Sebbene l’ cAMP e il Ca2+ siano i principali secondi messaggeri prodotti in seguito all’attivazione del recettore olfattivo, anche il cGMP viene sintetizzato e prende parte a processi quali l’adattamento, lo sviluppo neuronale e le risposte a lungo termine alla stimolazione odorosa. Molti aspetti della regolazione del cGMP nei neuroni sensoriali olfattivi, come il meccanismo di accoppiamento al recettore olfattivo e i “target” a valle, rimangono poco conosciuti. Per far luce su questi punti, abbiamo studiato le dinamiche e la distribuzione intracellulare del cGMP in neuroni sensoriali olfattivi di ratto in coltura transfettati con un sensore per il cGMP geneticamente codificato. Abbiamo dimostrato che neuroni sensoriali olfattivi trattati con stimoli farmacologici capaci di attivare le guanilato ciclasi solubili o di membrana presentavano un incremento del cGMP nell’intero neurone, dalle cilia al cono di crescita. In seguito alla stimolazione con gli odori, un incremento nei livelli di cGMP è stato nuovamente osservato in tutta la cellula, incluso il cono di crescita, dove il cGMP viene localmente prodotto. L’aumento odore - dipendente del cGMP è dovuto all’attivazione della guanilato ciclasi solubile ad opera dell’ossido nitrico (ON) e richiede un aumento di cAMP. Il collegamento tra l’ cAMP e l’ ON sembra essere costituito dall’aumento dei livelli di Ca2+ citosolico indotto sia dall’attivazione dei canali Ca2+ sulla membrana plasmatica, sia dalla mobilitazione del Ca2+ dai depositi intracellulari attraverso lo scambiatore di nucleotidi ciclici Epac. Infine abbiamo dimostrato che l’incremento di cGMP può indurre la fosforilazione di CREB a livello nucleare sia in vitro che in vivo. La sintesi locale di cGMP, accoppiata al recettore olfattivo espresso al cono di crescita, suggerisce che anche questo secondo messaggero, assieme all’ cAMP, può contribuire alla convergenza assonale dei neuroni sensoriali olfattivi. A questo punto ci siamo chiesti quale possa essere il meccanismi di attivazione, in particolare quali possano essere i ligandi del recettore olfattivo espresso al cono di crescita. Abbiamo ipotizzato che alcune molecole, espresse in gradiente nel bulbo olfattivo, possano legare e attivare il recettore olfattivo all’assone terminale. Per testare la nostra ipotesi, abbiamo studiato le dinamiche spazio – temporali di Ca2+ e cAMP in risposta alle molecole estratte dal bulbo olfattivo. I nostri dati dimostrano che un set di molecole è in grado di indurre un aumento di Ca2+ e cAMP nel cono di crescita di neuroni sensoriali olfattivi caricati col fura-2 o transfettati con un sensore per l’ cAMP. Al fine di dimostrare che tali incrementi di Ca2+ e cAMP erano effettivamente dovuti all’attivazione del recettore al cono di crescita, abbiamo espresso specifici recettori olfattivi in cellule HEK. L’aumento di Ca2+ è stato osservato esclusivamente nelle cellule HEK transfettate con diversi recettori olfattivi, ma non in quelle transfettate con il vettore vuoto (mancanti del recettore olfattivo), usate come controllo. Questi dati dimostrano la presenza di un set di molecole attive nel bulbo olfattivo in grado di attivare il recettore espresso al cono di crescita. Per capire il significato fisiologico delle variazioni di Ca2+ e cAMP sul comportamento di “turning” degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi, abbiamo svolto esperimenti di “real – time imaging” su neuroni sensoriali olfattivi isolati. Abbiamo quindi analizzato il comportamento del cono di crescita in risposta a un gradiente di molecole capaci di modulare Ca2+ e cAMP a livello del cono di crescita, come la forscolina, un attivatore generico delle adenilato ciclasi, gli odori e anche le molecole provenienti dal bulbo olfattivo. Da questi esperimenti emerge che la forskolina, gli odori e anche le molecole del bulbo, sono capaci di regolare il comportamento di “turning” del cono di crescita dei neuroni sensoriali olfattivi. Nel complesso, i nostri dati suggeriscono che alcune molecole del bulbo olfattivo, attraverso l’attivazione del recettore espresso al cono di crescita, contribuiscono a fornire ai neuroni sensoriali olfattivi le informazioni necessarie per raggiungere il corretto bersaglio nel del bulbo olfattivo.