Spectroscopic studies of the super relaxed state of skeletal muscle: a possible target for obesity and type 2 diabetes treatments

Sin dall’inizio dello scorso secolo la miosina ed il tessuto muscolare sono stati oggetto di ricerca scientifica. Circa 50 anni fa, l’abbondanza della miosina ed il perfezionamento dei protocolli di purificazione hanno contribuito ad iniziare lo studio del grande campo dei motori molecolari. L’importanza della miosina non è solo dovuta al suo ruolo fisiologico, ma anche per il suo grande contributo alla crescita delle conoscenze biochimiche. La miosina è un motore molecolare ed ha rappresentato e rappresenta tuttora un importante anello di congiunzione tra chimica e fisica in quanto campi di studio applicabili alla biologia. La miosina è il fulcro della conversione di energia chimica in lavoro nel tessuto muscolare ed è l’esempio perfetto della intima connessione fra biochimica e biofisica. Per lo studio delle funzioni molecolari del muscolo e della miosina si sono utilizzate numerose tecniche. Alcune di queste sono ormai piuttosto comuni, e anche molto potenti, quali la fluorescenza. Alcune altre sono meno conosciute in ambito biologico, come l’electron paramagnetic resonance (EPR) o risonanza paramagnetica elettronica, detta anche risonanza di spin elettronico. I primi lavori che vedono protagonista l’EPR su campioni di muscolo risalgono agli anni 80. Le fibre muscolari ed i miofilamenti sono campioni biologici particolari perchè sono fisiologicamente caratterizzati da un elevatissimo ordine microscopico e macroscopico. In tali campioni, l’EPR, essendo sensibile all'orientamento spaziale della molecola paramagnetica che porta l'elettrone spaiato, diventa realmente informativo. L’EPR è stato usato su campioni muscolari per descrivere la libertà di movimento della miosina durante i differenti stati del ciclo di interazione con l'actina. Usando questa ed altre tecniche, gli scienziati hanno studiato la miosina, ottenendo una profonda caratterizzazione di questo motore molecolare. Ci sono diversi modelli che descrivono tutti gli stati o passi che la miosina deve attraversare per completare un ciclo di interazione con l'actina. Recentemente, è stato identificato un nuovo stato della miosina. E’ stato denominato stato “Super Relaxed State” o SRX per via del fatto che è caratterizzato da una attività ATPasica molto bassa. Lo scopo di questa tesi è di caratterizzare il comportamento della miosina specialmente per quanto riguarda la stabilità e i dettagli strutturali dello stato Super Relaxed. Il lavoro sperimentale è iniziato con lo studio sullo stato SRX attraverso la modifica di uno dei suoi componenti. Abbiamo espresso mutanti di una proteina associata alla miosina, la catena leggera regolatoria o fosforilabile, che svolge un ruolo fisiologicamente importante per la stabilità dello stato. La proteina mutata è stata sostituita alla forma naturale in fibre muscolari. Lo scopo è di trovare un insieme di proteina mutante marcata con una sonda in grado di identificare quando lo stato SRX è presente. Abbiamo sviluppato quindi un saggio fluorimetrico e abbiamo effettuato un "high throughput screening" al fine di trovare una molecola in grado di destabilizzare lo stato rilassato. Il tessuto muscolare può essere un ottimo bersaglio per aumentare il metabolismo basale, destabilizzando lo stato SRX a basso consumo di ATP e quindi aumentando moderatamente la spesa energetica. Come possibile applicazione, questo potrebbe avere un impatto positivo sulla salute delle persone affette da obesità e diabete di tipo 2. Abbiamo identificato una molecola candidato e abbiamo dimostrato che ha le caratteristiche per essere un buon punto di partenza per sviluppare ulteriori studi farmacologici.