Towards an increased biocompatibility in total heart replacements: a new hybrid membrane for artificial blood pumps and the whole bioengineered heart

Il trapianto di cuore è l’unico trattamento dell’insufficienza cardiaca terminale, ma la sua applicazione è limitata dalla carenza di organi e dagli effetti collaterali delle terapie immunosoppressive. La necessità di nuove strategie terapeutiche ha portato allo sviluppo delle assistenze meccaniche ed al cuore bioingegnerizzato. Sebbene possano sembrare in contrasto, i cuori artificiali totali (TAH) sono impiantati a breve/medio termine e possono essere sviluppati ed introdotti nella clinica più rapidamente, mentre il cuore bioingegnerizzato si avvicina ad una soluzione definitiva, ma nonostante i risultati promettenti non è ancora stato prodotto un organo equivalente completo. La creazione di un nuovo rivestimento interno per i TAH e la generazione di una matrice decellularizzata per la bioingegnerizzazione del cuore sono stati l’obiettivo di questa tesi di dottorato al fine di migliorare la biocompatibilità dei sostituti cardiaci. Il rivestimento per i TAH è stato realizzato accoppiando pericardio bovino decellularizzato TriCol (DBP) ad un poliuretano, producendo una membrana ibrida (HM). Il DBP è stato valutato con istologie, immunofluorescenza combinata con microscopia a due fotoni (TPM) e quantificazione morfometrica. Le analisi superficiali della HM hanno mostrato la penetrazione del polimero. La citocompatibilità in vitro (ISO 10993-5) è stata valutata con cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) e mesenchimali staminali derivate da midollo osseo umano (hBM-MSC). I test hanno confermato inalterate morfologia, proliferazione, vitalità ed assenza di citotossicità. Nessuna attivazione del sistema del complemento (ISO 10993-4) è stata segnalata per HM. La scarsa endotelizzazione ed il verificarsi di tromboembolia nei TAH possono essere prevenuti accelerando l’adesione endoteliale con brevi peptidi sintetici. Gli scaffold TriCol DBP sono stati selettivamente e covalentemente legati ad Arg-Glu-Asp-Val (REDV) e REDV coniugato con rodamina (RhodREDV). Dopo la funzionalizzazione, la quantità di RhodREDV legato è stata quantificata con il TPM. La bioattività di REDV è stata valutata mediante semina statica di HUVEC in vitro. Il live/dead staining e la quantificazione della riduzione di MTS hanno dimostrato adesione precoce e migliore vitalità e proliferazione delle cellule nei DBP funzionalizzati con 10-5 M di REDV a 24 ore. Il saggio LDH ha riportato livelli trascurabili di citotossicità. Le valutazioni istologiche hanno rivelato un rivestimento cellulare quasi continuo. Il primo passo verso la bioingegnerizzazione del cuore è stato eseguito sviluppando un protocollo di decellularizzazione più conservativo. I cuori di ratto sono stati decellularizzati con miorilassante, inibitori delle proteasi, sodio dodecil solfato e Triton X-100. Le soluzioni sono state somministrate mediante perfusione coronarica retrograda. L’efficienza del protocollo è stata valutata con istologie, immunofluorescenza combinata con TPM, quantificazione del DNA e analisi proteomica. La citocompatibilità è stata eseguita mediante semina statica di hBM-MSC in ventricoli isolati (ISO 10993-5). I risultati hanno confermato morfologia inalterata, mantenimento della proliferazione e assenza di citotossicità. Le hBM-MSC hanno formato un monolayer continuo a 24 ore, mentre a 7 e 14 giorni era visibile la penetrazione. Concludendo, questa tesi di dottorato descrive i progressi verso la biocompatibilità dei sostituti cardiaci. La prima generazione di HM, basata su DBP e poliuretano, ha dimostrato la sua idoneità per il rivestimento interno dei TAH. La funzionalizzazione covalente e selettiva di DBP con 10-5 M di REDV ha provato la sua efficacia nell’accelerare l’adesione e proliferazione endoteliale. Un protocollo più conservativo e citocompatibile per la decellularizzazione del cuore totale è stato sviluppato e ha determinato la completa rimozione delle cellule endogene, preservando la matrice cardiaca.