Anti-cancer chemotherapeutics in target therapy: from advanced preclinical studies on promising Au(III) peptidomimetics toward the design of new receptor-recognizable metal-based agents

Attualmente, sebbene a livello clinico non vi siano farmaci in grado di agire selettivamente sui tessuti tumorali, la chemioterapia rimane la strategia d’elezione nel trattamento del cancro. Ad oggi, i farmaci a base di platino (cisplatino, carboplatino ecc.) sono tra i più utilizzati in ambito terapeutico nonostante la loro elevata tossicità accessoria. Prendendo come starting point le proprietà chimiche del platino e il pesante profilo tossicologico del cisplatino, sono stati recentemente progettati e testati biologicamente nuovi complessi ditiocarbammici di Au(III). Quest’ultimi hanno mostrato un’attività antitumorale particolarmente promettente (sia in vitro che in vivo), mancanza di resistenza crociata con il cisplatino e ridotta tossicità sia sistemica che renale, mettendo in luce un differente meccanismo di azione rispetto al chemioterapico di riferimento. Sulla base di questi risultati incoraggianti, ci siamo proposti di sfruttare le caratteristiche peculiari del microambiente tumorale al fine di ottenere un rilascio mirato dei nostri potenziali farmaci nei tessuti cancerosi con conseguente amplificazione dell’efficacia chemioterapica e ulteriore riduzione degli effetti collaterali. Per ottenere quindi un rilascio sito-specifico, abbiamo progettato di funzionalizzare il legante ditiocarbammico con biomolecole capaci di essere riconosciute e assimilate dalle cellule cancerose in seguito al legame con uno specifico trasportatore o recettore di membrana, sovraespresso rispetto alla cellula sana. Per quanto concerne i trasportatori presenti nel corpo umano, sono stati recentemente sintetizzati e studiati dei complessi ditiocarbammici di Au(III) funzionalizzati con di- e tripeptidi (d’ora in avanti denominati composti di 2° generazione), progettati per sfruttare i trasportatori peptidici PEPT1 e PEPT2. Il valore dei primi risultati biologici ottenuti ha portato al deposito di un brevetto PCT, esteso recentemente in numerosi Paesi del mondo. Come naturale prosieguo delle ricerche precedenti, in questo lavoro sono state prese in considerazione anche altre strategie mediate dai recettori sovraespressi nei tumori al fine di ottenere i nostri composti di 3° generazione. Con riferimento ai composti di 2° generazione, test preliminari di screening, condotti su svariate linee cellulari tumorali umane, hanno indicato AuD6 e AuD8 quali candidati adatti per ulteriori studi preclinici approfonditi. La loro sintesi e caratterizzazione chimica sono qui riportate insieme ai risultati biologici raccolti personalmente nei laboratori del “Barbara Ann Karmanos Cancer Institute” (Detroit, U.S.A) durante un periodo di ricerca di sei mesi sotto la supervisione del Prof. Q.Ping Dou. Sono stati condotti numerosi studi avanzati per valutare l’attività antitumorale sia in vitro sia in vivo e per delucidare un possibile meccanismo di azione nell’ipotesi di accesso alla fase di sperimentazione clinica I; è stata infine testata la tossicità acuta su modelli animali con risultati estremamente interessanti. E’ stata scelta come modello, date le sue elevate capacità invasive e metastatiche, la linea cellulare MDA-MB-231 (tumore della mammella triplo-negativo). E’ da sottolineare che questa linea cellulare è resistente al cisplatino mentre sia AuD6 che AuD8 hanno mostrato una buona attività antiproliferativa nelle prove in vitro, notevole attività antitumorale su modelli xenografici (somministrazione sottocutanea) e tossicità acuta trascurabile nei topi sia per via endovenosa che orale. Oltre a possedere un buon indice chemioterapico in termini di rapporto tossicità/efficacia, questi due composti sono risultati, sia in vitro che in vivo, dei potenti inibitori del proteasoma, importante complesso multicatalitico intracellulare deputato all’idrolisi di substrati proteici. Si è di conseguenza condotta un’indagine cristallografica mirata a delucidare il meccanismo di inibizione del proteasoma 20S da parte di AuD8 (composto modello) mediante tecniche biotecnologiche. Per quanto riguarda il profilo farmacocinetico dei composti in esame, si è preliminarmente considerata l’albumina sierica dato che è la principale proteina plasmatica ed è un noto trasportatore di farmaci e sostanze endogene quali vitamine e lipidi. Si è pertanto condotto uno studio al fine di verificare l’instaurarsi o meno di un’interazione tra AuD8 e la proteina del siero mediante dicroismo circolare e spettrofotometria di fluorescenza. In questi esperimenti si è utilizzato l’albumina bovina dato che condivide un’elevata omologia di sequenza con la controparte umana. Per quanto concerne i composti di 3° generazione – progettati anch’essi per agire in modo mirato sulle cellule cancerose e quindi capaci di eludere quelle sane – ci siamo concentrati sui recettori delle colecistochinine (CCK), iperespressi in parecchi tumori e appartenenti alla famiglia di recettori accoppiati alle proteine G. Il rilascio mirato del farmaco è possibile mediante complessazione del centro metallico con il peptide CCK8. Tale peptide è stato sintetizzato, purificato e caratterizzato tramite spettrometria di massa, analisi elementare, NMR ed FT-IR. Il corrispondente derivato ditiocarbammico di Au(III) è stato successivamente sintetizzato e caratterizzato parzialmente mediante spettroscopia 1H-NMR e spettrofotometria UV-Vis. Successivamente abbiamo sfruttato la cosiddetta “click chemistry” nelle fasi di progettazione e sviluppo di un’unità versatile a base di Au(III) da funzionalizzare con diversi peptidi recettoriali. In seguito al legame con il corrispondente peptide, tali recettori sono solitamente in grado di trasferire nel citoplasma il coniugato metallo-peptide. Una domanda di brevetto internazionale è in fase di deposito per proteggere la proprietà intellettuale del nostro approccio. Come naturale prosecuzione delle nostre ricerche, più recentemente si è utilizzato il metallo endogeno Cu(II) viste le sue interessanti proprietà biochimiche. La scelta del Cu(II) non è stata casuale ma dettata dal ruolo fondamentale che esso gioca nell’angiogenesi portandolo ad essere presente in concentrazione più elevata nelle cellule cancerose rispetto alle cellule sane. Tale peculiarità è stata sfruttata nella progettazione di agenti antitumorali a base di Cu(II) selettivi verso i tessuti neoplastici. Sono state preparate due diverse classi di complessi ditiocarbammici di Cu(II) al fine di ricavare possibili relazioni struttura-attività e conoscere approfonditamente il comportamento chimico di questo metallo di transizione in termini di condizioni di reazione da adottare e stabilità in diversi solventi. In questa tesi sono riportate le loro sintesi, caratterizzazioni chimiche e i dati biologici preliminari. Nel loro complesso, le informazioni qui raccolte saranno utilizzate per lo sviluppo futuro di composti a base rameica da inserire nel campo delle terapie mirate in oncologia.