Botrytis cinerea transcriptomic response to the active substance eugenol and role of Snf1 kinase in fungal pathogenesis

Botrytis cinerea è un fungo patogenico che provoca muffa grigia su più di 240 piante dicotiledoni con conseguenti enormi perdite economiche. Per controllare la malattia in campo e per prevenire i danni post-raccolta, sono necessari frequenti trattamenti antiparassitari, aumentando così il rischio di diffusione di ceppi resistenti ai fungicidi e gli effetti negativi per l'ambiente e la salute umana. Pertanto, le nuove molecole con diversa modalità di azione o i fungicidi alternativi dovrebbero essere introdotti per gestire meglio la malattia, per preservare meglio l'ambiente e per aumentare la sicurezza degli alimenti. Diversi gruppi di sostanze naturali possono essere utilizzati come alternativi ai fungicidi di sintesi e tra questi composti, gli oli vegetali essenziali sono largamente sperimentati per la loro conosciuta attività antimicrobica e antifungina. L’eugenolo è un composto efficace per diversi oli essenziali, il componente principale di olio di garofano, che viene estratto dalle gemme dei chiodi di garofano e usato come antisettico locale nella medicina tradizionale. Il meccanismo dell'effetto antimicotico dell’eugenolo è stato esaminato in Saccharomyces cerevisiae e su alcuni funghi patogeni vegetali. I principali effetti descritti di questo componente fenolico sembrano essere la rottura dell'integrità della membrana cellulare fungina e della parete cellulare; tuttavia non è chiara la modalità precisa d'azione dell’ eugenolo. Per affrontare la modalità di azione dell’ eugenolo, l’analisi del trascrittoma è stata effettuata utilizzando matrici NimbleGen 4x72K. Le colture di B. cinerea sono state trattate con eugenolo alla concentrazione efficace (EC80) di 250 μg ml-1, e di controllo (non trattato) e i miceli trattati sono stati raccolti dopo 6 h e 12 h. E’ stata analizzata statisticamente la risposta trascrizionale di B. cinerea all’ eugenolo e sono stati valutati i geni differentemente espressi. E’ stato trovato un arricchimento significativo di geni down-regolati nella biosintesi dell'ergosterolo, nei DNA classe fattori di replica, nel percorso del glutatione, nel trasporto transmembrana e nella biosintesi della tossina botrydial, mentre i geni up-regolati sono stati rilevati in diverse categorie funzionali in merito a risposta da stress. Un approccio moderno allo sviluppo dei fungicidi è un disegno razionale di farmaci che rispecchiano il target come nodo fondamentale della complessa rete cellulare. Nei lieviti, la proteina chinasi Snf1 è un regolatore globale ed è un importante percorso di segnalazione del glucosio attraverso il controllo della risposta a stress nutrizionali e ambientali. Per caratterizzare il ruolo di B. cinerea Snf1 chinasi, i mutanti di delezione del gene codificato sono stati ottenuti e analizzati in vitro e in vivo. I mutanti Δsnf1 sono cresciuti più lentamente con una riduzione del 20-80 % su semplice zuccheri, polisaccaridi, e fonti lipidiche di carbonio a pH 5 e per lo più a pH 7. E’ stata anche misurata l'attività enzimatica prodotta da ceppi mutanti ed è stata osservata una significativa riduzione dell'attività di xilanasi e un aumento dell'attività della poligalatturonasi rispetto al tipo selvatico. Questi risultati suggeriscono che la Snf1 chinasi non agisce come attivatore generale degli enzimi che degradano la parete cellulare di B. cinerea ma sembra sia coinvolta in un eventuale regolazione dipendente dal pH. Nel test di patogenicità, la virulenza dei mutanti Δsnf1 è stata ridotta del 60-90 % rispetto al tipo selvatico. I mutanti Δsnf1 sono stati alterati in sporulazione pura; in realtà, essi non producono conidiofori normali con macroconidi, ma solo microconidi. In conclusione, la proteina chinasi Snf1 di B. cinerea regola la conidiazione, l’ utilizzo delle fonti di carbonio e influenza fortemente la virulenza; quindi potrebbe essere un possibile bersaglio per i nuovi fungicidi