The Mitochondria Fission Protein DRP1 is Required for Muscle Mass Maintenance

I muscoli scheletrici costituiscono il 40% di tutto l’organismo e sono caratterizzati da un’elevata attività metabolica. Il muscolo scheletrico è un tessuto molto plastico e dinamico che adatta la propria massa in risposta a diversi stimoli. L’esercizio fisico e gli stimoli anabolici, per esempio, inducono un aumento della sintesi proteica e della massa muscolare, un processo chiamato ipertrofia. Un aumento della degradazione proteica, invece, provoca perdita della massa muscolare, detta atrofia. L’atrofia muscolare è una conseguenza di diverse condizioni patologiche come cancro, diabete, AIDS, cardiomiopatie ed invecchiamento. I mitocondri hanno un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi muscolare in quanto forniscono l’energia necessaria al muscolo. Infatti, l’atrofia muscolare è caratterizzata da alterazioni nel network mitocondriale (Romanello et al., 2010). Per questo motivo, è particolarmente importante preservare la funzionalità mitocondriale nei tessuti caratterizzati da un’elevata attività metabolica come neuroni, muscoli scheletrico e cardiaco. In questi tessuti, il controllo della funzionalità dei mitocondri è esclusivamente basato sui processi di fusione e fissione mitocondriale. La fusione mitocondriale aumenta la connessione tra i mitocondri in modo da favorire lo scambio di proteine, metaboliti e DNA mitocondriale. La fissione, invece, porta alla frammentazione di questi organelli permettendo, così, la rimozione dei mitocondri disfunzionanti attraverso un meccanismo chiamato mitofagia. L’importanza di questi due processi nel muscolo scheletrico è stata recentemente evidenziata da analisi di trascrittomica e di proteomica, i quali hanno dimostrato la progressiva perdita, durante l’invecchiamento, di proteine mitocondriali coinvolte nei meccanismi di fusione e fissione (Ibedunjo et al., 2013). Drp1, una proteina appartenente alla famiglia delle GTPasi, ha un ruolo chiave nella fissione mitocondriale. In particolare, Drp1 è una proteina citosolica che trasloca sulla membrana mitocondriale esterna dei mitocondri danneggiati e disfunzionanti, dove si assembla formando un anello multimerico che induce la divisione mitocondriale (Smirnova et al., 2001). Recentemente alcuni studi hanno dimostrato che l’overespressione di Drp1 nel muscolo induce perdita della massa muscolare e riduce la performance durante l’esercizio fisico (Touvier et al., 2015). Ciò conferma alcuni dati ottenuti precedentemente, i quali dimostrano che l’aumentata espressione nel muscolo scheletrico di altre proteine coinvolte nella fissione mitocondriale, inducono atrofia muscolare ed una diminuita funzionalità dei mitocondri (Romanello et al., 2010). Purtroppo, gli studi basati sulla tecnica dell’overespressione di proteine sono spesso accompagnati da effetti secondari, perciò abbiamo deciso di studiare il ruolo di Drp1 nel muscolo scheletrico utilizzando un approcio di tipo loss of function. Abbiamo, quindi, generato un modello di topo Drp1 knock-out muscolo-specifico (MLC1f-Drp1 KO). La delezione di Drp1 nel muscolo è risultata essere letale e causa atrofia muscolare. La perdita della massa muscolare è mediata da una riduzione della sintesi proteica, che è dovuta all’attivazione della via di segnale UPR. La via UPR, infatti, blocca la sintesi proteica attraverso la fosforilazione del fattore eif2α. Inoltre, la via UPR induce un aumento dei livelli di espressione della citochina FGF21 nel muscolo scheletrico. L’induzione di FGF21 determina alcuni importanti cambiamenti nel metabolismo degli animali knock-out: ipoglicemia, resistenza all’ormone della crescita e diminuzione dell’espressione di IGF-1 nel fegato. Questi cambiamenti sono responsabili del fatto che gli animali Drp1-deleti appaiono più piccoli rispetto ai controlli. La mancata espressione di Drp1 nel muscolo induce anche un aumento nella degradazione delle proteine attraverso FoxO3. FoxO3 è un fattore che controlla le vie degradative nel muscolo scheletrico. In particolare, FoxO3 induce l’espressione di Atrogin1 e MuRF1, due ubiquitine ligasi muscolo-specifiche, e di MUSA1, un’ubiquitina ligasi recentemente identificata nel nostro laboratorio (Sartori et al., 2013). Questi dati dimostrano l’attivazione del sistema ubiquitina-proteasoma nei muscoli degli animali knock-out. Inoltre, l’analisi attraverso real-time PCR di alcuni geni coinvolti in diversi step del flusso autofagico, suggerisce che anche l’attivazione del sistema autofagia-lisosoma contribuisce alla degradazione proteica nel nostro modello animale. Considerando che la delezione di Drp1 induce la morte precoce dell’animale, abbiamo deciso di studiare il suo ruolo nel muscolo adulto attraverso la generazione di un modello knock-out inducibile muscolo-specifico (HSA-Drp1 KO). Sorprendentemente, la delezione di Drp1 in età adulta provoca una significativa perdita di peso corporeo a causa della riduzione della massa muscolare. Inoltre, i topi knock-out appaiono più deboli in quanto sia la forza assoluta, sia la forza normalizzata, sono più basse rispetto ai controlli. Ciò suggerisce che la diminuzione della forza è indipendente dall’atrofia. L’assenza della divisione mitocondriale impatta anche sulla dimensione e sulla morfologia dei mitocondri, portando all’accumulo di mitocondri più grandi, ma con una diminuita funzionalità. Infatti, i mitocondri nei muscoli knock-out sono caratterizzati da alterazioni nel mantenimento del potenziale di membrana e una ridotta efficienza respiratoria. Studiando i meccanismi coinvolti nell’atrofia muscolare, abbiamo notato che la via di segnale UPR e i sistemi di degradazione (Ubiquitina-Proteasoma e Autofagia-Lisosoma) sono conservati nei due modelli animali. Tuttavia, la sintesi proteica non risulta alterata in età adulta. La ridotta forza muscolare, l’attivazione della via UPR e la disfunzione mitocondriale possono essere dovute ad una alterazione della fisiologia del calcio. Per questo motivo, abbiamo analizzato l’omeostasi del calcio nelle fibre muscolari derivate dal muscolo FDB. I risultati dimostrano che la delezione di Drp1 altera il rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico. Ciò si può prevenire inibendo l’ingresso di calcio nei mitocondri, attraverso il silenziamento di MCU. È interessante notare che queste alterazioni precedono la perdita della massa muscolare, suggerendo che esse possano essere la causa del fenotipo osservato. Questi risultati indicano che la dinamica e la morfologia mitocondriali potrebbero influenzare in parte il controllo dei livelli di calcio nel muscolo scheletrico. Infine, gli animali knock-out, analizzati 7 mesi dopo la delezione di Drp1, mostrano segni di invecchiamento precoce e una grave atrofia muscolare. Inoltre, i muscoli sono caratterizzati da degenerazione e rigenerazione delle fibre muscolari, come evidenzia l’accumulo di fibre centro-nucleate. Riassumendo, i nostri risultati dimostrano che la morfologia e la funzione dei mitocondri influenzano l’attivazione di vie di segnale che controllano la massa muscolare. Interventi terapeutici mirati a mantenere l’equilibrio dei processi di fusione e fissione mitocondriali possono, perciò, essere di fondamentale importanza per preservare la massa muscolare e prevenire l’atrofia.