Assessment of transsulfuration enzymes pattern in a human astrocytoma cell line

The transsulfuration pathway is the key pathway in the sulfur-containing amino acid metabolism, that, through the action of two enzymes, cystathionine-β-synthase and cystathionine-γ-lyase allows the synthesis of cysteine. Both cystathionine-β-synthase and cystathionine-γ-lyase catalyze also H2S production, in a series of reactions, from non-canonical substrates. In this study a novel enzyme-coupled colorimetric assay for cystathionine-β-synthase was developed, based on the use of cystathione-γ-lyase as ancillary enzyme. The method was adopted to demonstrate the presence of the complete transsulfuration enzyme machinery in a human astrocytoma cell line. The response of the rate limiting enzyme of the transsulfuration pathway, cystathione-γ-lyase, to a severe cysteine depletion was also evaluated. In addition, to unveil the H2S producing role of the transsulfuration pathway enzymes, a reaction chamber for measuring hydrogen sulfide was developed. With this new approach, the H2S produced in the liquid phase by cystathionine-γ-lyase, was measured in the gas phase of the chamber headspace. Adopting this system the reactions leading to H2S from cysteine and homocysteine were kinetically characterized.

La via di transulfurazione è centrale nel metabolismo degli amminoacidi solforati, questa, attraverso l'azione di due enzimi, la cistationina-β-sintasi e la cistationine-γ-liasi permette la sintesi di cisteina a partire da serina e omocisteina. Entrambi gli enzimi catalizzano anche la produzione di acido solfidrico attraverso una serie di reazioni a partire da substrati non canonici. In questo lavoro è stato sviluppato un nuovo metodo colorimetrico accoppiato alla cistationine-γ-liasi come enzima ancillare per la misurazione della cistationina-β-sintasi. Il metodo è stato usato per dimostrare la presenza di una via di transulfurazione completa in una linea di astrocitoma umano. Inoltre è stata studiata la risposta dell'enzima limitante la via di transulfurazione, la cistationina-γ-liasi in condizioni di forte deplezione di cisteina. Per analizzare il ruolo degli enzimi della via di transulfurazione sulla produzione endogena di acido solfidrico è stata messa a punto una camera di reazione per la misurazione del suddetto gas. Con questo nuovo approccio, l'acido solfidrico prodotto in soluzione dalla cistationine-γ-liasi è stato misurato nella fase gassosa attraverso un sensore amperometrico. Usando questo sistema le reazioni che producono acido solfidrico a partire da cisteina e da omocisteina sono state caratterizzate dal punto di vista cinetico.