16S amplicon Next Generation Sequencing approach evaluation and its application to food microbial communities characterization

Gli alimenti sono ecosistemi complessi in quanto vengono influenzati sia da fattori intrinseci che da fattori estrinseci, come la composizione chimica, il profilo microbiologico e l'ambiente, che possono avere forte impatto sul prodotto finale. In particolare nei formaggi i microbi sono il fattore più influente perché possono modificare sia la vita commerciale che il sapore ed il gusto del prodotto. Inoltre il microbiota stabilisce delle complesse interazioni internamente alla comunità batterica e con l'ambiente, a tal punto che al giorno d'oggi queste dinamiche sono state solo in parte evidenziate con metodi tradizionali coltura-dipendenti. Di conseguenza i metodi coltura-indipendenti, come il Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS), stanno diventando un potente strumento per studiare in profondità le comunità microbiche presenti in una varietà di nicchie ecologiche, compresi gli alimenti. È probabile che ormai tali tecniche debbano essere considerate complementari ai metodi di microbiologia coltura-dipendenti. In questo ampio progetto abbiamo valutato e applicato un approccio NGS sul gene 16S rRNA allo studio della vita commerciale della Ricotta, delle sue materie prime e ad alcuni studi di tecnologia degli alimenti su formaggi molli o stagionati addizionati con colture batteriche antagoniste. In tutti questi studi i metodi NGS sono sempre stati supportati da approcci cultura-dipendenti, altri metodi molecolari e analisi biochimiche. I vari studi sono suddivisi tra i successivi capitoli di questa tesi. Per prima cosa utilizzando una comunità batterica artificiale abbiamo valutato l'impatto del workflow di processo del protocollo 16S-NGS sulla struttura e sull'identificazione della comunità reale. Con questo approccio abbiamo dimostrato che l'analisi bioinformatica, e principalmente la strategia di raggruppamento delle sequenze in OTU (Operational Taxonomic Unit), può influenzare la diversità della comunità di tipo alfa (intra-campione), ma non la sua beta-diversità (inter-campioni). In questo senso entrambe le strategie possono essere utilizzate al fine di confrontare le strutture delle comunità microbiche. Inoltre il protocollo si è dimostrato robusto e ripetibile. In secondo luogo abbiamo valutato le materie prime (siero e panna) utilizzate per la produzione di ricotta, dimostrando che la qualità microbiologica di queste materie deve essere migliorata. Poiché queste hanno mostrato una forte biodiversità (principalmente di Streptococcaceae e Pseudomonadaceae) e un'alta concentrazione di spore aerobie (da 10 a 104 UFC/ml, non presenti nella panna), il loro utilizzo per la produzione della ricotta potrebbe danneggiare il prodotto finale. Non di meno l'approccio combinato NGS con Gas Cromatografia su sieri congelati con difetti organolettici ha mostrato che lo stoccaggio non igienico delle materie prime conduce alla produzione di composti di fermentazione o di ossidazione lipidica, guidati anche da particolari batteri come Acinetobacter, Lactococcus e Pseudomonas. Nel terzo capitolo abbiamo valutato la vita commerciale della Ricotta durante l'inverno e l'estate, dimostrando che il microbioma della Ricotta era composto principalmente da batteri sporigeni, Bacillus, Paenibacillus e Clostridium (oltre l'80% di abbondanza relativa). Inoltre abbiamo trovato una ricotta estiva con colorazione rosa e, applicando l'approccio molecolare Multi-locus Sequence Typing, abbiamo dimostrato che il batterio che causava il difetto apparteneva al gruppo del Bacillus cereus, in particolare si trattava di un ceppo di B. mycoides/wehienstephanensis. Tale lavoro è stato pubblicato nella rivista Food Microbiology. Nell'ultimo capitolo abbiamo applicato l'analisi NGS a studi di culture ausiliari aggiunte a formaggi a pasta molle o stagionati, al fine di evidenziare il loro effetto antibatterico. Abbiamo così valutato l'effetto anti-Gammaproteobacteria di alcuni ceppi come L. rhamnosus, L. sakei e Carnobacterium maltoaromaticum in formaggi freschi industriali con problematiche di rigonfiamento della confezione e deterioramento prematuro. Dal punto di vista NGS abbiamo evidenziato che C. maltoaromaticum riusciva ad eliminare quasi tutti i contaminanti a temperature di conservazione differenti. In conclusione, con l'approccio NGS, è stato possibile migliorare la valutazione della qualità microbiologica alimentare e sostenere la ricerca tecnologica alimentare. Infatti i risultati ottenuti in questo studio dimostrano come l'applicazione di tecnologie NGS, descrivendo approfonditamente le comunità microbiche, potrebbe diventare nel prossimo futuro uno strumento scalabile ed efficace, adatto per migliorare la qualità e la sicurezza alimentare, nonché favorire la produzione di nuovi alimenti.