Transcription factor IKAROS: from leukaemia genetics to lymphocyte development

L’ematopoiesi è un processo differenziativo che, a partire da cellule staminali ematopoietiche multipotenti, da origine a tutte le cellule del sangue. Ogni step differenziativo durante questo processo è finemente regolato da un insieme di fattori di trascrizione che agiscono in concerto bloccando la trascrizione di geni legati alla staminalità ed attivando geni essenziali per la specificazione ed il differenziamento delle diverse linee maturative ematopoetiche: linfoide, mieloide, eritroide e magacariocitoide. Non è quindi sorprendente che mutazioni o traslocazioni che interessano questi fattori di trascrizione siano spesso associate con l’insorgenza di leucemie. IKAROS fa parte di una famiglia di fattori di trascrizione principalmente coinvolta nella specificazione in senso linfoide delle cellule ematopoietiche. IKAROS è caratterizzato da due domini funzionali: un dominio N-terminale, composto da 4 zinc-finger, necessario per il legame della proteina al DNA, ed un domino C-terminale, formato da 2 zinc-finger, indispensabile per la omo-etero-dimerizzazione della proteina e la sua conseguente attivazione. IKAROS è espresso a livello delle cellule staminali ematopoietiche, e la sua espressione aumenta durante il differenziamento linfoide, silenziando geni legati alla staminalità ed allo sviluppo eritro-mieloide e potenziando l’espressione di geni legati allo sviluppo linfoide. In topi knockout per il gene Ikzf1 la linfopoiesi è gravemente compromessa, con un ritardo nello sviluppo delle cellule T ed un completo blocco nel differenziamento dei linfociti B, cellule natural killer e delle cellule dendritiche. Questo fenotipo è dovuto all’incapacità delle cellule staminali ematopoietiche di differenziare in cellule progenitrici della linea linfoide in assenza di Ikaros. La mancanza di Ikaros in questi topi porta all’insorgenza di leucemie o linfomi a cellule T nel ~95% dei casi entro sei mesi dalla nascita. Nell’uomo, aberrazioni associate ad IKZF1 sono rare nelle leucemie T, ma, al contrario, delezioni di parte del gene sono presenti nel 15% delle leucemie pediatriche a fenotipo B (BCP-ALL), e la percentuale raggiunge circa il 70% se si considera un particolare sottogruppo caratterizzato dalla presenza del cromosoma aberrante Philadelphia. In questa tesi abbiamo studiato il ruolo di IKAROS nelle leucemie pediatriche e durante il differenziamento dei linfociti B. Nel terzo capitolo l’incidenza di mutazioni puntiformi e piccole inserzioni/delezioni (indel) del gene IKZF1 viene studiata in una coorte europea di pazienti pediatrici affetti da BCP-ALL con presenza del cromosoma Philadelphia. Grazie all’utilizzo del sequenziamento di nuova generazione abbiamo sequenziato i 7 esoni codificanti di IKZF1 in 98 pazienti IKZF1-non deleti ed in 61 pazienti IKZF1-deleti. Tra i 98 pazienti non deleti abbiamo riscontrato la presenza di 7 mutazioni puntiformi e 7 indel, mentre 3 mutazioni puntiformi sono state evidenziate nella coorte di pazienti IKZF1 deleti. Tutte le aberrazioni da noi trovate sono predette avere un effetto deleterio sulla funzionalità della proteina. Queste aberrazioni genetiche sono principalmente localizzate sul quinto e sull’ottavo esone, che codificano per i domini di legame al DNA e di dimerizzazione, rispettivamente. Nei pazienti che non presentavano macrodelezioni di IKZF1, le mutazioni da noi identificate sembrano avere lo stesso impatto prognostico delle macro-delezioni, presentando una maggior incidenza di eventi avversi nei pazienti trattati prima dell’introduzione degli inibitori di tirosin-chinasi rispetto a quelli a cui sono stati somministrati in sinergia con la chemioterapia. Un paziente mutato identificato durante il nostro screening ha mostrato la presenza della stessa delezione di un singolo nucleotide sia nel campione alla diagnosi che in quello in remissione, suggerendo una possible origine costituzionale della mutazione. Nel quarto capitolo è stata indagata la natura costituzionale della mutazione nel paziente e nella sua famiglia. La stessa delezione in eterozigosi è stata identificata nella madre del paziente ed in altri 3 portatori in 3 generazioni; abbiamo inoltre scoperto un secondo caso di leucemia pediatrica all’interno della famiglia verificatasi più di 45 anni fa. La delezione riscontrata nella famiglia dà origine ad una proteina tronca con la perdita della parte terminale del dominio di legame al DNA e la completa perdita del dominio di dimerizzazione al C-terminale. L’assenza di questi domini comporta una ridotta affinità di legame al DNA ed ad una localizzazione nucleare diffusa. L’mRNA dell’allele mutato è stato ritrovato nelle cellule del midollo osseo del paziente in remissione completa, così come in cellule mononucleate del sangue di una delle sorelle, anch’essa portatrice della delezione. Nelle medesime cellule è stata riscontrata anche la presenza della proteina tronca, seppur in minor quantità rispetto alle isoforme wt. Nel quinto capitolo viene descritto e caratterizzato un nuovo modello cellulare murino per lo studio della regolazione dell’espressione genica mediata da Ikaros. L’espressione di Ikaros aumenta durante il differenziamento dei linfociti B, ad è necessario per arrestare il ciclo cellulare di cellule B progenitrici permettendo il riarrangiamento della catena leggera delle immunoglobuline. Per meglio comprendere la cinetica ed il meccanismo con cui Ikaros media l’espressione genica, abbiamo creato una linea murina di cellule preB knockout per il gene Ikzf1 grazie alla tecnica di “gene editing” della CRISPR-Cas9, ed abbiamo quindi trasdotto queste cellule con una cassetta contenente un sistema inducibile di Ikaros, che ci permette di controllare la traslocazione di Ikaros dal citoplasma al nucleo. Ikaros-inducibile è in grado di traslocare efficacemente nel nucleo e di legarsi al promotore di un suo gene target molto noto, ma la sua abilità di regolare l’espressione genica appare parzialmente compromessa. Infatti, Ikaros-inducibile promuove l’aumento di espressione di alcuni suoi geni target, ma non è in grado di silenziare 3 geni da noi selezionati e noti per essere silenziati da Ikaros. Nel sesto capitolo abbiamo utilizzato il sistema di Ikaros-inducibile per studiare i cambiamenti metabolici che avvengono durante lo sviluppo dei linfociti B, utilizzando un modello cellulare murino di cellule preB. Tre sensori basati sulla tecnica FRET, per quantificare i livelli cellulari di ATP, glucosio e di attivazione della proteina AMPK, sono stati trasdotti nel nostro modello cellulare, e sono quindi state eseguiti esperimenti preliminari utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza e FACS dopo 16 ore di induzione