A next generation sequencing approach for the study of ancient fungal specimens belonging to the Pier Andrea Saccardo collection preserved at the University of Padua

Le collezioni micologiche rappresentano un’enorme risorsa di informazioni molecolari che può essere sfruttata per ottenere importanti sequenze di DNA. Infatti, è stato dimostrato che i progetti di DNA barcoding che coinvolgono materiale fungino proveniente da collezioni micologiche possono aumentare la quantità di informazioni molecolari relative alle diverse specie fungine nei database pubblici. Tuttavia, queste raccolte sono una risorsa poco sfruttata per la creazione di datasets di riferimento basati su campioni accuratamente identificati, a causa della difficoltà nell’ottenere sequenze di DNA dal materiale conservato all’interno degli erbari. La raccolta micologica di Pier Andrea Saccardo, di oltre un secolo, conservata nell'erbario dell'Orto Botanico di Padova, contiene circa 70.000 campioni fungini di cui oltre 4.000 sono esemplari tipo. I tipi di questa collezione sono stati spesso richiesti da micologi di tutto il mondo per revisioni morfologiche e conseguenti riclassificazioni tassonomiche, ma non erano mai stati coinvolti in progetti di sequenziamento finora. Di conseguenza, lo scopo di questa ricerca è stata quella di applicare un approccio di DNA barcoding per ottenere sequenze della regione ITS (internal transcribed spacer), il barcode utilizzato per l'identificazione delle specie fungine, dai campioni conservati in questa collezione. Questa regione è considerata un marcatore adatto per studi molecolari che coinvolgono materiale micologico antico, poiché solo corte regioni di DNA possono essere ottenute da DNA antico e degradato. Inoltre, in caso di fallimento nell’amplificazione della regione ITS, è possibile aumentare il successo dell'amplificazione/sequenziamento analizzando separatamente le due regioni non codificanti ITS1 e ITS2 che formano l'intera regione ITS. In questo lavoro di tesi, è stato applicato un metodo di sequenziamento Illumina MiSeq per ottenere sequenze ITS1/ITS2 superando i problemi relativi all'alto livello di degradazione del DNA dei campioni della collezione micologica e la presenza di contaminazioni da DNA fungino esogeno. Il metodo ha richiesto l'ottimizzazione delle diverse fasi coinvolte nella preparazione dei campioni per il sequenziamento e nell'analisi bioinformatica dei dati, e la sua efficacia è stata prima testata per ottenere sequenze ITS2 da 36 esemplari fungini non-tipo appartenenti al genere Peziza. Nonostante la presenza sia di contaminazioni fungine esterne che di contaminazione incrociata tra i campioni della collezione, questo metodo di sequenziamento ha permesso di recuperare sequenze della regione ITS2 da 23 dei 36 campioni studiati e anche una rivalutazione tassonomica di alcuni campioni a livello di specie e altri a livello di genere o livello tassonomico superiore. Successivamente, questo approccio di sequenziamento di nuova generazione è stato utilizzato per ottenre sequenze ITS1/ITS2 da campioni tipo appartenenti al genere Nectria e da tipi Nectria-simili classificati nella collezione come membri di altri generi. Molti di questi tipi furono morfologicamente revisionati in passato da esperti micologi e posti in sinonimia con altre specie o riclassificati come membri di nuovi generi. Le sequenze ITS1/ITS2 sono state ottenute per 25 diversi tipi (30 in totale considerando campioni multipli) su 76 campioni coinvolti nello studio. L'analisi combinata dei dati morfologici e molecolari suggerisce la necessità di riclassificare alcuni tipi di Nectria/Nectria-simili precedentemente riclassificati solo su base morfologica e alcuni tipi mai considerati per una revisione tassonomica. Infatti, per 11 tipi è stato confermato il nome originale della specie, per quattro e cinque tipi sono state proposte rispettivamente nuove combinazioni di nomenclatura e sinonimie, mentre per altri cinque l'assegnazione tassonomica è stata possibile solo a livello di genere. Poiché i campioni tipo costituiscono una parte integrante della classificazione e della nomenclatura dei funghi e data l'importanza eccezionale e mondiale della collezione Saccardo, questi risultati forniscono materiale per una revisione tassonomica di inestimabili campioni tipo. Inoltre, il metodo proposto in questa ricerca non solo ha fornito un valore scientifico aggiuntivo alla collezione Saccardo, ma può essere applicato per ottenere importanti sequenze da materiale d’erbario, espandendo così i database con sequenze ITS ben annotate.