A novel role for heparanase in the onset of liver fibrosis establishment

I proteoglicani dell'eparan solfato sono importanti componenti strutturali e funzionali delle membrane basali costituiti da un asse proteico (solubile o transmembrana) legato covalentemente a catene altamente solfatate di glicosaminoglicani chiamate eparan solfato. L'eparanasi è l'unico enzima in grado di tagliare le catene di eparan solfato a livello di specifici siti intracatena, generando frammenti di circa 5-7kDa. Essa si definisce endo-β-D-glucuronidasi, in quanto capace di tagliare i legami glicosidici tra i monomeri di acido glucuronico a glucosamina che costituiscono l'eparan solfato. A livello intracellulare (endosomale e lisosomale), l'eparanasi partecipa al turnover dei proteoglicani dell'eparan solfato associati alla membrana cellulare mentre, quando secreta, è coinvolta nella degradazione e nel rimodellamento della matrice extracellulare. Data l'interazione elettrostatica dell'eparan solfato con fattori di crescita, citochine ed enzimi, il suo taglio da parte dell'eparanasi facilita indirettamente anche il rilascio e la diffusione di queste molecole. L'eparanasi svolge poi funzioni non enzimatiche in quanto è in grado di regolare l'espressione genica attraverso l'attivazione di vie di segnalazione intracellulari. Nello svolgere queste funzioni, l'eparanasi è coinvolta sia in processi fisiologici che patologici. In particolare l'eparanasi ha un ruolo significativo nella progressione tumorale e nelle malattie glomerulari renali. Inoltre, è stato recentemente dimostrato il suo coinvolgimento anche nell'infiammazione cronica a livello intestinale e renale così come nella fibrosi tubulo-interstiziale. In generale, la fibrosi è un processo sregolato di riparazione tissutale che insorge in seguito ad un danno persistente e ad infiammazione cronica. Nel fegato, il progressivo accumulo di matrice extracellulare può portare a cirrosi e insufficienza epatica. In questo processo, l'attivazione delle cellule di Kupffer e delle cellule stellate (HSC) svolge un ruolo fondamentale, le prime nella risposta infiammatoria, le seconde nella fibrogenesi. Finora, nessuno studio ha dimostrato un coinvolgimento dell'eparanasi nello sviluppo della malattia cronica epatica. Considerata la riproducibilità dei meccanismi che concorrono allo sviluppo delle malattie croniche, questo studio ha lo scopo di: i) verificare se l'eparanasi sia up-regolata nel corso della malattia cronica di fegato, ii) studiare l'eventuale regolazione della sua espressione e iii) studiare i possibili effetti sullo sviluppo della malattia. Il quadro di espressione temporo-spaziale dell'eparanasi è stato studiato in topi con danno cronico epatico indotto da somministrazioni di tetracloruro di carbonio (CCl4) per 1, 2, 8 e 12 settimane. La progressione del danno cronico e della fibrosi è stata valutata tramite le colorazioni istologiche di Azan-Mallory ed Ematossilina-Eosina. Estese aree centrolobulari ad elevata attività necro-infiammatoria e fibrosi si sono osservate dopo 1 e 2 settimane di trattamento che hanno progressivamente generato fasci fibrotici e cirrosi micronodulare osservati dopo 8 e 12 settimane di trattamento. Analisi di espressione genica (tramite real time RT-PCR) e proteica (tramite Western blot e immunofluorescenza), hanno dimostrato un significativo aumento di espressione dell'eparanasi dopo 1 e 2 settimane di trattamento ma non dopo 8 e 12 settimane suggerendo un possibile ruolo dell'enzima nelle fasi iniziali del danno cronico. Analisi di immunoistochimica hanno poi evidenziato una localizzazione dell'eparanasi nelle aree centrolobulari con danno necro-infiammatorio e fibrosi. Per identificare la sorgente cellulare di eparanasi responsabile del suo aumento tissutale, sono state condotte analisi in vitro su colture cellulari ed analisi di co-immuofluorescenza su sezioni di fegato trattato con CCl4 per 1 e 2 settimane. Data la localizzazione dell'eparanasi nelle aree fibrotiche e il ruolo fondamentale delle HSC nella malattia cronica di fegato, ci siamo chiesti se l'espressione di eparanasi aumenti nelle HSC durante la loro attivazione. A tal scopo, cellule primarie sono state isolate da fegato di ratto e indotte ad attivarsi tramite coltura su plastica. Dopo 15 giorni dall'isolamento, i livelli di espressione dell'eparanasi e di marcatori del transdifferenziamento (α-SMA, fibronectina, TGF-β e collagene I) sono significativamente aumentati rispetto a cellule coltivate per 7 giorni. Tuttavia, nonostante analisi di immunofluorescenza abbiano evidenziato l'espressione di eparanasi da parte di HSC attivate in vivo a 1 e 2 settimane di trattamento con CCl4, un più significativo grado di co-localizzazione è stato osservato con i macrofagi marcati con F4/80 e CD68. Dato il principale coinvolgimento dei macrofagi nell'aumento di eparanasi epatica in sede di infiammazione, è stata quindi condotta un'analisi sui possibili meccanismi di up-regolazione dell'eparanasi da parte dei macrofagi infiammatori. A tal scopo, cellule primarie di Kupffer sono state isolate da fegato di ratto e trattate con LPS e TNF-α, due importanti stimoli pro-infiammatori. Al contrario dell'LPS che non ha alterato l'espressione dell'eparanasi, il TNF-α ne ha indotto un significativo aumento. Anche macrofagi umani U937, trattati con concentrazioni crescenti di TNF-α, hanno aumentato l'espressione genica e proteica dell'eparanasi, con un meccanismo dose-dipendente. Tramite Western blot sui mezzi condizionati di U937 trattate o meno con TNF-α, abbiamo inoltre dimostrato un incremento di enzima extracellulare in presenza di TNF-α, suggerendo come questo fattore stimoli anche la secrezione di eparanasi. Due osservazioni hanno poi fornito ulteriori evidenze sul possibile ruolo del TNF-α come regolatore dell'espressione dell'eparanasi nella malattia cronica epatica: in primo luogo il significativo aumento di espressione del TNF-α nel tessuto epatico solo a 1 e 2 settimane di intossicazione da CCl4 e, in secondo luogo, la sua co-localizzazione con l'eparanasi alle stesse settimane di trattamento. Tra le altre molecole pro-infiammatorie testate, mentre IFN-γ ha stimolato la trascrizione genica dell'eparanasi, IL-4 ne ha ridotto l'espressione suggerendo una diversa regolazione dell'eparanasi da parte dei macrofagi a seconda del loro stato di polarizzazione M1 e M2. L'elevata espressione dell'eparanasi negli stadi iniziali della malattia cronica di fegato ha portato a chiederci quale potesse essere il suo ruolo nel processo di fibrogenesi. Dato il coinvolgimento delle cellule di Kupffer nell'attivazione delle HSC tramite il rilascio di stimoli pro-fibrotici, abbiamo verificato se fosse possibile un meccanismo di regolazione anche attraverso il rilascio di eparanasi. A tale scopo, cellule stellate LX-2 sono state trattate con i mezzi condizionati delle U937 precedentemente indotte a produrre eparanasi tramite stimolazione con TNF-α. Il coinvolgimento dell'eparanasi nell'attivazione delle LX-2 è stato verificato utilizzando un inibitore dell'eparanasi durante il trattamento. I risultati hanno dimostrato come l'eparanasi sia in grado di regolare l'espressione di α-SMA e di fibronectina da parte delle LX-2. Oltre alla degradazione della matrice extracellulare, anche la capacità di promuovere l'attivazione dei macrofagi è un'attività dell'eparanasi già nota. In questo studio, tramite un saggio di migrazione in vitro, è stato dimostrato come la forma latente dell'eparanasi sia in grado di stimolare anche la migrazione dei macrofagi. Infine, per verificare il coinvolgimento dell'eparanasi nella fibrosi epatica umana, i livelli di attività dell'eparanasi sono stati misurati nel plasma di soggetti sani e pazienti affetti da malattia cronica di fegato, ad eziologia virale o autoimmune e a diversi stadi di fibrosi. A conferma di quanto riscontrato nel modello animale, abbiamo osservato come, indipendentemente dall'eziologia della malattia epatica, l'attività plasmatica dell'eparanasi aumenti nei pazienti con fibrosi lieve e moderata rispetto ai soggetti sani, ma ritorni basale nei pazienti cirrotici. Inoltre, nei pazienti, l'attività plasmatica dell'eparanasi correlava negativamente con il grado di stiffness epatica. Complessivamente, i nostri risultati indicano un coinvolgimento dell'eparanasi nella malattia cronica di fegato ma solo nelle sue fasi iniziali. Macrofagi infiammatori e, in misura minore, HSC attivate costituiscono un'importante fonte di eparanasi. In questo contesto, l'eparanasi secreta nell'ambiente extracellulare può avere un ruolo nell'attivazione delle HSC mediata dai macrofagi e nella migrazione dei macrofagi stessi.