NMR based Metabolomics in Food Chemistry

La metabolomica è definita come l'analisi sistematica di centinaia o migliaia di piccoli metaboliti presenti in un sistema vivente. È emerso come un importante campo di studio insieme ad altre, già affermate scienze "omiche", vale a dire, genomica, proteomica e trascrittomica. La metabolomica è ben consolidata nel campo della medicina, nello studio della tossicità di farmaci e nella diagnostica. Tra le tecniche analitiche esistenti, NMR è veloce, riproducibile e non distruttiva, utile per fornire una fotografia informativa sui metaboliti in determinate condizioni. Dati NMR forniscono informazioni metaboliche che caratterizzano i campioni quando combinati con una pre-elaborazione dei dati e con strumenti chemiometrici, come le tecniche di statistica multivariata. La metabolomica basata sull’NMR è ancora in espansione nel campo della chimica degli alimenti. In questo contesto, questa tesi di Dottorato si concentra su due aspetti principali, che mostrano applicazioni della metabolomica basata sull’NMR in chimica degli alimenti. 1. Molti prodotti nutraceutici possiedono potente attività antiossidante, come dimostrato in molti test chimici in vitro e in diverse prove in vivo. Tuttavia, il meccanismo della loro attività non è completamente studiato in dettaglio. A causa della loro scarsa biodisponibilità e metabolismo veloce, sono ancora necessari studi in vivo sugli effetti antiossidanti. Abbiamo condotto esperimenti longitudinali su ratti Sprague Dawley (SD) utilizzando due prodotti antiossidanti nutraceutici comunemente disponibili, vale a dire, curcumina (capitolo 2) e resveratrolo (capitolo 3). Gli effetti di diverse dosi di estratti antiossidanti standardizzati somministrati per via orale nei ratti sani sono stati studiati mediante analisi metabolomica non mirata (untargeted) basata su LC-MS e spettrometria NMR. Gli esperimenti sono stati eseguiti lungo diversi periodi di tempo per diversi antiossidanti. Le variazioni del metaboloma urinario sono state valutate attraverso il monitoraggio della composizione delle urine di 24 ore usando 1H-NMR e HPLC-MS. I due differenti approcci sono stati in grado di rilevare le variazioni dei livelli urinari di marcatori antiossidanti, portando all’osservazione di diversi metaboliti e dimostrando così la complementarità di queste due tecniche analitiche per scopi metabolomici. Strumenti di analisi come la spettroscopia NMR e MS in combinazione con chemiometria possono delineare l'impatto del tempo, dello stress, dello stato nutrizionale, e di perturbazioni ambientali su centinaia di metaboliti contemporaneamente. Ciò comporta complessi enormi set di dati che devono essere analizzati mediante un protocollo statistico accurato. La nostra strategia ha compreso una pre-elaborazione dei dati, l’analisi dei dati e la validazione dei modelli statistici. Dopo varie fasi di elaborazione di dati, l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’analisi dei minimi quadrati parziali (PLS) sono state utilizzate per identificare i biomarcatori urinari. I modelli PLS sono stati convalidati dai test di permutazione e le variabili di importanza critica sono stati convalidati attraverso analisi univariata. 2. La seconda parte di questa tesi (capitoli 4 e 5) descrivono l'uso di metabolomica basata su NMR come strumento veloce, conveniente ed efficace per la discriminazione di origine e la scoperta di biomarcatori in analisi degli alimenti. Tradizionalmente, la determinazione dell'origine floreale del miele è condotta mediante analisi palinologica. Il metodo si basa sulla individuazione di polline mediante ispezione microscopica. Tuttavia, l'analisi melissopalinologica richiede perizia ed inoltre non è una tecnica molto affidabile per la discriminazione di origine botanica di alcuni titpi di miele. Inoltre, la regolamentazione del miele nell'Unione Europea (Codex Alimentarius 2001; Commissione Europea 2002) sottolinea che le origini botaniche e geografiche del prodotto devono essere stampate sull'etichetta, per evitare frodi, come l'adulterazione con zucchero industriale, vendita di prodotti sotto falso nome o aggiunte di miele di diversa origine floreale. Pertanto, vi è la necessità di stabilire un metodo per distinguere miele di diverse origini. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un approccio metabolomico basato sull’NMR che ha utilizzato l'analisi statistica multivariata per discriminare l'origine botanica (capitolo 4) ed entomologica (capitolo 5) di diversi tipi di miele. statistica multivariata ci ha aiutato ad identificare i segnali più importanti per differenziare il miele sia dal punto di vista botanico che entomologico. I set di dati ottenuti sono stati utili nella ricerca di marcatori responsabili della discriminazione dei diversi campioni di miele di diverse specie botaniche e prodotti da diverse specie di api.