Chronic lung allograft dysfunction: clinical and experimental study

INTRODUZIONE Il trapianto di polmone è l’unica opzione terapeutica per alcune patologie polmonari terminali. Notevoli progressi sono stati fatti in questo ambito, tuttavia la sopravvivenza dell’organo dopo 5 anni è inferiore al 50%, principalmente a causa dello sviluppo del rigetto cronico. Il rigetto cronico si presenta in modo eterogeneo, in quanto può essere caratterizzato da una forma ostruttiva (sindrome della bronchiolite obliterante, BOS) o da una restrittiva (RAS). La BOS e il suo corrispondente aspetto istopatologico, la bronchiolite obliterante (BO), rappresentano la principale forma di rigetto cronico (~75%). L’eziologia e l’esatta patogenesi della BOS/BO non sono ancora state completamente chiarite in quanto diversi meccanismi immunitari sembrano essere coinvolti nel suo sviluppo e sembra essere la conseguenza di un processo indotto da meccanismi dipendenti/indipendenti dagli alloantigeni. Infatti, il ruolo dell’alloimmunità nello sviluppo della BOS/BO è stato dimostrato da tempo, mentre quello dell’autoimmunità è emerso solo recentemente. Pochi lavori sperimentali e clinici hanno dimostrato che il collagene V e la tubulina K-α1, modificati nel danno da ischemia e riperfusione, possono indurre la risposta autoimmune, sia umorale che cellulo-mediata. L’interleuchina17 (IL17), una citochina proinfiammatoria coinvolta in patologie autoimmuni ed infettive, è stata proposta recentemente come fattore cruciale nello sviluppo del rigetto cronico. Lo sviluppo di modelli animali, che subiscono una procedura trapiantologica analoga all’umana, risulta di grande importanza al fine di chiarire i meccanismi patogenetici legati allo sviluppo della BOS/BO, di identificare biomarcatori precoci e di provare l’efficacia di nuove terapie. Attualmente, due importanti aspetti vengono largamente discussi nei modelli di trapianto ortotopico nei roditori: 1) la riproducibilità della procedura chirurgica e 2) l’identificazione del migliore genotipo (inbred o outbred) per lo sviluppo di lesioni immunologiche simili a quelle umane. SCOPO DELLA RICERCA I principali obiettivi di questa ricerca sono stati: 1) sviluppo di un modello animale di trapianto ortotopico di polmone riproducibile con lesioni immunologiche simili a quelle umane, in particolare quelle tipiche del rigetto cronico; 2) verificare l’ipotesi che IL17/IL23 giochi un ruolo chiave nello sviluppo del rigetto cronico mediante uno studio scrupoloso nei modelli preclinici e in casi clinici emblematici. MATERIALI E METODI Due modelli animali sono stati utilizzati per eseguire il trapianto ortotopico di polmone (LT): il modello outbred (20 polmoni sinistri CD SPF sono stati trapiantati in VAF) e il modello inbred (32 polmoni sinistri di ratti Lewis sono stati trapiantati in Fisher 344). Esclusivamente i ratti con sopravvivenza a lungo termine (sacrificati 30 e 90 giorni dopo LT) sono stati studiati in modo approfondito dal punto di vista immunologico mediante: a) ricerca di anticorpi anti-donatore (DSA) mediante citometria a flusso sui campioni ematici; b) valutazione morfologica ed immunofenotipica di lesioni immunologiche acute e croniche sviluppatesi nel polmone trapiantato; c) analisi immunoistochimica e molecolare (PCR semiquantitativa) del meccanismo IL17/IL23 nell’organo trapiantato e nel BAL dei modelli animali e nelle biopsie transbronchiali di monitoraggio di due casi clinici emblematici di pazienti che hanno sviluppato la BO. RISULTATI La mortalità perioperatoria e la disfunzione precoce dell’organo trapiantato (entro le 24 ore) erano più elevate nel gruppo di animali outbred rispetto agli inbred (solo 2/20 ratti outbred sono sopravvissuti): uno presentava rigetto cellulare acuto (ACR) con coesistente BO precoce, l’altro un rigetto cronico tardivo. Nei primi 15 giorni dopo LT i topi inbred presentavano raramente lesioni immunologiche (solo 1/11: 9%) e si trattava di ACR lieve (A1B1). In questo periodo i polmoni trapiantati inbred mostravano danno da ischemia/riperfusione o infezioni. In 2/6 (33%) dei polmoni trapiantati inbred è stato riscontrato un importante ACR (≥A2B1) 30 giorni dopo LT. Il sacrificio a 90 giorni è risultato ottimale per lo sviluppo di lesioni immunologiche: ACR (≥A2B1) e BO (lesioni precoci e tardive) sono state riscontrate in 7/15 (46%) e 8/15 (53%) animali rispettivamente, indipendentemente dal trattamento di immunosoppressione. Gli animali con ACR o BO presentavano livelli di Ig DSA maggiori rispetto a quelli che non presentavano alcun segno di rigetto (rispettivamente 70% e 34% vs 13%). Una forte positività immunoistochimica per IL17 è stata riscontrata nei polmoni trapiantati dei topi inbred che avevano sviluppato ACR e BO. Non erano evidenti differenze significative nell’espressione di IL17 nelle cellule infiammatorie (macrofagi e linfociti) di polmoni inbred con ACR e BO, mentre è risultata maggiore nelle cellule epiteliali ed endoteliali di polmoni inbred con BO rispetto a quelli con ACR. Non è stata riscontrata positività nei polmoni di animali senza alcun segno di rigetto. L’espressione di IL23 era elevata sia in assenza che in presenza di rigetto. L’analisi molecolare dell’espressione di IL17 e IL23 nel BAL ha dimostrato maggiori livelli di mRNA nei polmoni trapiantati con ACR rispetto a quelli con BO. Tutte le biopsie di monitoraggio dei due casi emblematici caratterizzate da ACR e BO hanno mostrato un’elevata espressione di IL17 con lo stesso pattern riscontrato nel modello preclinico. CONCLUSIONI I ratti outbred, che potrebbero essere considerati più simili all’uomo data la loro diversità genetica, non possono essere considerati un modello riproducibile di LT a causa dell’elevata mortalità precoce. E’ stato sviluppato un modello riproducibile di rigetto acuto cellulare e cronico nei ratti inbred (da Lewis a Fisher 344) e il sacrificio 90 giorni dopo il trapianto è risultata la tempistica ottimale. IL17, notevolmente espressa nell’ACR e nella BO, è un mediatore cruciale nelle lesioni immunologiche post-trapianto e potrebbe rappresentare un importante target terapeutico nella trapiantologia clinica.