Characterization of a novel brachytic2 (br2) allele in maize

A partire dalla "Rivoluzione verde" sono state selezionate varietà di colture a taglia ridotta, ad esempio riso e sorgo. Molti sono i vantaggi derivanti: un maggior utilizzo di energia per la produzione della granella rispetto alla crescita vegetativa, la possibilità di aumentare la densità delle piante per superficie, la maggior resistenza ai danni da vento e la minor perdita di granella durante raccolta e trasporto. Molte linee mutanti nane sono caratterizzate da difetti in sintesi, metabolismo o trasporto di ormoni: brassinosteroidi e gibberelline soprattutto. Un difetto nel trasporto di auxina caratterizza le linee mutanti di mais br2 e di sorgo dw3. Test di allellismo condotti all'Università di Purdue (IN) incrociando la linea di mais NC238 a statura ridotta con altre piante a statura ridotta indicarono che la linea NC238 è un mutante di tipo brachytic 2. Nel 2003 è stato clonato il gene br2/pgp1/abcb1 responsabile del fenotipo a bassa statura dovuto alla riduzione della lunghezza degli internodi vicini alla base del fusto. Il gene abcb1 codifica per la proteina ABCB1 che appartiene alla famiglia di trasportatori MDR (Multidrug Resistant), sottofamiglia B. Questa proteina è l'omologo della proteina trasportatrice di auxina di Arabidopsis ABCB1. L'ormone auxina svolge molti ruoli nella regolazione dello sviluppo della pianta, sintesi, degradazione e coniugazione contribuiscono a modulare i livelli di auxina. Le proteine ABCB, assieme a PIN, PILS e AUX/LAX creano una flusso direzionale di auxina dai siti di sintesi (aree meristematiche, giovani tessuti) alle zone dove è necessaria. L'auxina svolge ruoli nello sviluppo embrionale, mantenimento delle cellule indifferenziate, architettura del fusto, risposta tropica, sviluppo e tropismo delle radici. La maggior parte di queste funzioni sono state studiate in Arabidopsis. Questa tesi si focalizza sull'analisi fenotipica e morfologica della linea br2:NC2382. Una pianta alta era stata isolata in una popolazione di NC238. La mutazione infatti è dovuta a un'inserzione di un trasposone e a seguito di un fenomeno di reversione, in cui il trasposone si è reinserito in un altro lucus del genoma, si era originato un revertente. Questa pianta revertente è stata auto-fecondata per ottenere una progenie da usare negli esperimenti come linea di riferimento wild type. In parallelo, l'allele mutante br2 di NC238 è stato introgresso nella linea di riferimento B73. La presente tesi si suddivide in quattro parti. Nel primo capitolo sono state introdotte la biologia, morfologia e genetica del mais (Zea Maize). Sono stati descritti la sintesi, il metabolismo e i ruoli dell'ormone auxina. In questa sezione è stata inserita la review dal titolo "The role of auxin transporters in monocot development" ("Il ruolo dei trasportatori di auxina nello sviluppo delle monocotiledoni") scritta durante il periodo all'estero presso il laboratorio del prof. Johal (Università di Purdue, IN). La review descrive le funzioni dei diversi trasportatori di auxina nelle monocotiledoni: mais, riso sorgo e brachipodio, comparandole con i rispettivi ruoli in Arabidopsis, quando trasportatori omologhi esistono. Inoltre una descrizione della struttura e classificazione degli elementi trasponibili delle piante è stata fatta. Nel secondo capitolo viene descritta l'analisi dei tratti fenotipici. Le pubblicazioni che studiano e caratterizzano i mutanti br2 descrivono difetti nell'allungamento del fusto dovuti alla ridotta lunghezza degli internodi alla base del fusto. Inoltre, difetti nella struttura dei vasi del fusto di br2 sono stati osservati. In un altro caso alterazioni nelle cellule delle foglie e nell'angolo fogliare sono stati descritti. Nessun articolo descrive in dettaglio il sistema radicale di br2. La caratterizzazione della linea br2:NC238 è stata fatta misurando i tratti dell'apparato radicale di piante allo stadio di una settimana. Inoltre sono state eseguite misure fenotipiche su piante in fioritura, coltivate in campo all'azienda agraria sperimentale dell'Università di Padova "L.Toniolo", per identificare eventuali alterazioni dei tratti della pianta. Sono state misurate: la statura delle piante, le distanze, i diametri e il numero dei nodi, l'altezza della spiga più alta, le ramificazioni del pennacchio. Inoltre, è stata fatta una analisi dell'apparato radicale fino a un metro di profondità di suolo. Le radici sono state estratte attraverso carotaggi del terreno alla base del fusto, lavate, scannerizzate e i dati elaborati con un software apposito. Inoltre l'anatomia delle cellule del fusto di br2:NC238 e la loro localizzazione di auxina sono state osservate. Il terzo capitolo riguarda la caratterizzazione della mutazione a livello genetico. Sono stati amplificati e sequenziati il clone genomico e il trascritto, delle linee br2:NC238 e il suo revertente. E' stato fatto lo studio dell'inserzione che causa la mutazione in br2:NC238. E' stata analizzata la struttura della sequenza e sono state interrogate banche dati di sequenze genomiche, sequenze ripetute e elementi trasponibili. Inoltre, è stata fatta un'analisi di espressione dei geni codificanti trasportatori di auxina. Il quarto capitolo riguarda lo studio della linea B73 nella quale l'allele mutato di NC238 è stato inserito. Il clone genomico di abcb1 e il trascritto sono stati amplificati e sequenziati per confermare la mutazione e l'alterazione della trascrizione del gene. Sono state fatte le analisi fenotipiche per confermare che l'allele conferisce le caratteristiche morfologiche anche in linee genotipiche diversi. In conclusione, le analisi hanno mostrato che il fenotipo di br2:NC238 appare quando le piante hanno 7 foglie. Negli stadi precedenti, br2:NC238 e il revertente sono indistinguibili. Allo stadio di fioritura, br2:NC238 è caratterizzato da ridotta lunghezza degli internodi alla base del fusto e maggior diametro dei nodi bassi. Il resto della pianta è normale. La mutazione br2 nella linea NC238 è dovuta a un'inserzione di un trasposone in una regione intronica del gene. Il trasposone è caratterizzato da due regioni invertite terminali (TIR) ed è fiancheggiato da due sequenze target dirette duplicate (TSD) che sono presenti anche nelle sequenza genica del revertente. Nonostante la similarità con diversi elementi trasponibili, il trasposone non può essere allocato in nessuna delle famiglie trasposoniche note. A livello trascrizionale, il trasposone altera lo splicing del gene. L'analisi di espressione dei trasportatori di auxina nel fusto allo stadio di 3 e 7 foglie mostra alterazione nei profili di trascrizione. Inoltre, un aumento di espressione della forma di splicing predetta dal Maize Genome Database (T02) è stato osservato. La presenza dell'allele abcb1 mutato nella linea di riferimento B73 causa l'insorgenza del fenotipo tipico dei mutanti br2. Il risultato indica che l'introgressione dell'allele abcb1 di br2:NC238 in un'altra linea genetica produce una linea di altezza ridotta senza alterare gli altri tratti della pianta e suggerisce la possibilità di introdurre la linea NC238 nei programmi di breeding.