Dopamine and dopamine-quinones toxicity in Parkinson's disease: cellular models revealing a possible role for superoxide dismutases

La malattia di Parkinson è una diffusa sindrome neurodegenerativa che affligge circa il 2% della popolazione oltre l’età dei 60 anni. La caratteristica principale della patologia è la preferenziale morte dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta del mesencefalo, e la presenza di inclusioni proteinacee chiamate Lewy body nei neuroni sopravvissuti. Nel 10% dei casi, la malattia è collegata a mutazioni su diversi geni, tra i quali α-synucleina, DJ-1, PARKIN, PINK1 e LRRK2, ma nella maggior parte dei casi (Parkinson sporadico) (Gwinn-Hardy 2002) l’eziologia è ancora sconosciuta. Da studi post mortem e da modelli in vitro e in vivo per il PD è stata rilevata una possibile connessione tra le forme genetiche e quelle sporadiche che implica sia la disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo come fattori centrali nella patogenesi della malattia (Gilgun-Sherki Y. et al. 2001, Mythri R. B. et al. 2011). Lo stress ossidativo è una condizione in cui le capacità antiossidanti della cellula non sono in grado di sopperire alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Questa condizione di sbilanciamento tra la produzione e la detossificazione dei ROS causa danni irreversibili ai componenti cellulari come lipidi, proteine e DNA, portando alla morte cellulare (Lotharius et al. 2002). Tra gli enzimi coinvolti nella difesa antiossidante delle cellule, le superossido dismutasi giocano un ruolo fondamentale poiché catalizzano la dismutazione dell’anione superossido in ossigeno molecolare e perossido di idrogeno (Fridovich 1995). Poiché lo stress ossidativo non spiega da solo la selettiva morte dei neuroni dopaminerigici, l’ipotesi è che la dopamina stessa abbia un ruolo chiave. In condizioni fisiologiche, la dopamina viene metabolizzata nel citosol e stoccata all’interno delle vescicole sinaptiche grazie all’azione del trasportatore vescicolare delle monoamine 2 (VMAT2) dove è stabilizzata dal basso pH (Erickson, J. D 1992). Se la concentrazione citosolica di dopamina supera quella fisiologica, essa viene metabolizzata ad acido 3,4-diidrofenilacetico e perossido di idrogeno grazie all’azione dell’enzima monoamina ossidasi (MAO) e aldeide deidrogenasi, o sequestrata nei lisosomi dove può auto ossidarsi a formare neuromelanina. Se non è metabolizzata in questi pathway, la dopamina può essere ossidata a dopamino-chinoni (DAQs) (spontaneamente o enzimaticamente) (Sulzer, D., 2000, Elsworth, J. D. 1997), una reazione che produce anche specie reattive dell’ossigeno (ROS). Con queste premesse, abbiamo valutato due linee di ricerca usando un modello in vitro per il PD (la linea cellulare SH SY5Y): la prima riguardante l’effetto della dopamina e le sue forme di ossidazione sulla vitalità cellulare, la seconda sul potenziale ruolo dell’over espressione delle superossido dismutasi (1 e 2). Utilizzando differenti tecniche abbiamo iniziato a valutare quale pathway di morte cellulare veniva attivato dalla dopamina e dalle sue forme ossidate. Andando a valutare la frammentazione nucleare, uno degli ultimi stadi dell’apoptosi, abbiamo determinato che sia la dopamina sia i chinoni inducono l’attivazione di questo processo di morte. Per confermare il processo apoptotico, abbiamo valutato un altro marker: l’esternalizzazione delle fosfatidil-serine (PS): uno dei primi stadi di attivazione del processo apoptotico. con l’utilizzo di ANNEXIN-V-FLUOS, una sonda specifica per le PS. Mediante la tecnica di citoflurimetria abbiamo confermato che sia la dopamina che i chinoni attivano l’apoptosi. Successivamente abbiamo voluto valutare se la dopamina e i chinoni avevano effetti tossici a livello extracellulare o necessitavano di entrare nelle cellule. Pre-trattando le cellule con l’inibitore specifico del trasportatore della dopamina (GBR 12909) abbiamo dimostrato che la tossicità della dopamina è dipendente dal suo trasporto all’interno della cellula (in quanto il trattamento con l’inibitore ha avuto un effetto protettivo per le cellule), mentre i chinoni non lo necessitano. Poichè lo stress ossidativo è stato proposto come possibile meccanismo implicato nella patogenesi della malattia, e la chimica ossidativa della dopamina (auto ossidazione e ossidazione mediata da enzimi) porta alla produzione di specie radicaliche, abbiamo valutato la produzione dell’anione superossido (la prima specie radicalica prodotta soprattutto a livello del mitocondrio) usando una sonda specifica. I dati dimostrano che solo il processo auto ossidativo della dopamina porta alla produzione di anione superossido e che questo processo è dipendente dall’internalizzazione della dopamina a livello del trasportatore. Per comprendere maggiormente il meccanismo alla base della tossicità del processo di ossidazione e ossidazione mediate da enzima della dopamina abbiamo valutato altri marker di apoptosi. Poiché dai dati precedenti è stato visto che solo la dopamina citosolica era in grado di indurre la produzione dell’anione superossido a livello del mitocondrio, abbiamo voluto verificare se i due processi ossidativi della dopamina, attivassero differenti pathway apoptotici (i prevalenti comprendo la via mediata dai recettori di morte, l’altro quella mitocondriale). Dati preliminari dimostrano una marcata attivazione della caspasi 3 e la conseguente inattivazione della poli (ADP) ribosio polimerasi in conseguenza al trattamento con i chinoni suggerendoci di investigare maggiormente sulle possibili differenze tra i diversi processi ossidativi della dopamina. La seconda parte del progetto si è focalizzata sul possibile ruolo delle superossido dismutasi 1 e 2 contro la tossicità indotta dalla dopamina e dai suoi prodotti di ossidazione. L’over espressione sia della SOD1 che della SOD2 hanno rivelato un effetto protettivo contro la produzione di anione superossido indotto dalla dopamina, mentre non hanno presentato alcun effetto contro la tossicità indotta dai chinoni rimarcando il ruolo dell’anione superossido nella tossicità indotta dalla dopamina. Nel presente progetto di dottorato, abbiamo valutato l’ipotesi che lo stress ossidativo indotto dalla dopamina e dalle sue specie ossidate possa avere un ruolo chiave nella specifica degenerazione dei neuroni dopaminergici caratteristici della malattia di Parkinson. I dati ottenuti sembrano dare indicazioni sulla differente attivazione di pathway di morte cellulare indotta dalla dopamina e dalle sue forme ossidate con un differente ruolo nella produzione dell’anione superossido. Poichè lo stress ossidativo è considerate uno dei meccanismi che collegano il Parkinson sporadico a quello genetico e la dopamina, nella sua chimica ossidativa, porta alla produzione di specie radicaliche, riuscire a capire quale pathway di morte cellulare è attivato e in quale misura, è cruciale per lo sviluppo di terapie per impedire l’inizio e la progressione della malattia. I dati derivanti dall’over espressione delle superossido dismutasi dimostrano che composti che impediscono la formazione dell’anione superossido (come SOD-mimetici che sono attualmente usati per altre patologie) potrebbero avere un ruolo protettivo contro lo stress ossidativo e la conseguente morte cellulare indotta. Inoltre, anche composti in grado ci bloccare la cascata apoptotica indotta da dopamina e chinoni potrebbe proteggere dalla morte le cellule affette in questa malattia neurodegenerativa