Innovative technologies and bioactive compounds for the control of polyphenol oxidase

L’imbrunimento enzimatico dei prodotti agro-alimentari in post-raccolta e le problematiche associate alla melanogenesi nel settore cosmetico comportano consistenti perdite qualitative ed economiche. Il principale responsabile di entrambi questi fenomeni è la tirosinasi o polifenol ossidasi (PPO, EC 1.14.18.1), una ossido riduttasi contenente un ione rame all’interno del sito attivo, che catalizza due differenti reazioni enzimatiche di ossidazione di substrati polifenolici e quindi rende possibile la successiva formazione di composti scuri. Negli ultimi anni, lo studio di nuovi sistemi ecocompatibili per il controllo dell’attività enzimatica si è focalizzato sulle tecnologie non-termiche e sugli inibitori di origine naturale da proporre in alternativa ai convenzionali trattamenti termici ed ai tradizionali additivi chimici. Un impulso alla ricerca in questa direzione è stato dato dalla dimostrazione del loro impatto negativo non solo sulla qualità organolettica e nutrizionale dei prodotti agro-alimentari e sulla stabilità delle formulazioni cosmetiche, ma anche sulla sicurezza in seguito ad ingestione o contatto. Partendo da questi presupposti il progetto di ricerca alla base di questa tesi di dottorato vuole valutare, attraverso saggi in vitro e in vivo, l’efficacia anti-imbrunimento di tre possibili sistemi alternativi: una tecnologia UV-A basata su fonte di luce a LED (primo contributo) e due estratti naturali ottenuti da sottoprodotti agro-industriali, gli idrosol degli agrumi (CHIs; secondo contributo) e gli scarti di potatura del vigneto (VPRs; terzo contributo). Nel primo contributo, il trattamento basato su luce UV-A, alla lunghezza d’onda di 390 nm, è stato applicato, a temperature ambiente, in intervalli fino un’ora complessiva, su fette di mela (Golden Delicious, Granny Smith, Fuji) e pera (Abate Fétel, Decana), utilizzando un prototipo di illuminatore a LED, dove alcuni parametrici fisici, quali numero di diodi, voltaggio e distanza dal campione, sono stati impostati in modo tale da garantire il massimo irraggiamento (2.43·10-3 Wm-2). La variazione totale di colore (ΔE) e la sua riduzione percentuale (%RΔE) sono state misurate utilizzando un colorimetro; le mele trattate mostravano una maggiore percentuale di riduzione del colore rispetto alle pere (rispettivamente 58.3% e 25.5% in media, dopo un irraggiamento di 60 minuti). Le ottime potenzialità inibitorie del trattamento con luce UV-A nei confronti dell’attività PPO sono state confermate anche dalle prove elettroforetiche e zimografiche eseguite su una tirosinasi commerciale di origine fungina (TYR) e sulla PPO estratta dalle fette di mela Golden Delicious dopo l’irraggiamento. Sulla base dei risultati ottenuti, l’efficacia anti-imbrunimento di questa tecnologia non termica, basata su luce UV-A con fonte a LED dipende non solo da tempo e intensità di irraggiamento, ma anche da tipo e cultivar di frutti utilizzati. Nel secondo contributo, l’inibizione tirosinasica da parte di tre diversi tipi d’idrosol, co-prodotti durante distillazione in corrente di vapore delle bucce di cedro, arancia e limone (CH, LH, OH, rispettivamente), è stata determinata spettrofotometricamente, utilizzando (+)–epicatechina e L-DOPA come substrati fenolici rappresentanti, rispettivamente, l’imbrunimento enzimatico delle piante e la melanogenesi della pelle. Tutti gli idrosol di agrumi testati mostravano un’inibizione enzimatica di tipo misto (tra 21.8 e 68.9 %), in base al tipo e alla concentrazione di substrato fenolico utilizzato. L’analisi gas cromatografica (GC) degli idrosol di agrumi ha permesso di individuare tra i terpeni alcuni noti inibitori dell’enzima TYR, quali mircene, sabinene, geraniolo e citrale. Il terzo contributo esamina le potenzialità anti-imbrunimento e antiossidante di alcuni centrifugati di bacche d’uva provenienti dagli scarti di potatura del vigneto di due diverse cultivar, Barbera (B) e Merlot (M), durante le stagioni di vendemmia dell’anno 2013 (1) e 2014 (2). Tra gli scarti di diradamento, quelli di Merlot inibivano maggiormente l’attività dell’enzima commerciale TYR, quantificata allo spettrofotometro in presenza del substrato catecolo, rispetto a quelli di Barbera (68.2% e 67.8% per M1 e M2, rispettivamente; 56.3% and 58.8% per B1 e B2, rispettivamente) mostrando un’inibizione di tipo acompetitiva; i risultati spettrofotometrici sono stati confermati anche dai test su piastra. Le tecniche zimografiche applicate sulle isoforme enzimatiche isolate da TYR e da alcune PPO vegetali (mele Fuji e Golden Delicious; pere Abate Féte; patate Bintje) così come le prove in vivo, condotte su diverse fette di frutta (mele Fuji, Golden Delicious e Granny Smith; pere Abate e Decana) verdura (patate Bintje; melanzane) e su fette essiccate di mela Golden Delicious, hanno dimostrato che il grado d’inibizione dipende principalmente dall’origine dell’enzima. Infatti, questo trattamento chimico non si è rivelato efficace nei confronti della PPO di pera. Tuttavia, lo studio effettuato sugli scarti di potatura di vigneto ha messo in luce le loro potenzialità non solo come agenti anti-imbrunimento, ma anche come sbiancanti e antiossidanti; le loro molteplici proprietà possono essere correlate al loro alto contenuto in acidi organici ed epigallocatechin gallato (EGCG). Nel complesso, questa ricerca dimostra come l’efficacia inibitoria sia legata principalmente non solo all’origine della PPO, ma anche alla dose e al tipo di inibitore applicato. La tecnologia UV-A con fonte a LED, gli idrosol di agrumi e gli scarti di potatura del vigneto rappresentano sistemi sicuri, economici ed a basso impatto ambientale per controllare l’imbrunimento enzimatico nel settore agro-alimentare e cosmetico. Inoltre, questi estratti naturali, ricchi in composti bioattivi con forti proprietà inibitorie, suggeriscono un possibile impiego alternativo che potrebbe conferire un interessante valore aggiunto a questi sottoprodotti della filiera agro-industriale.