Predictive factors of non-sentinel axillary lymph nodes in breast cancer patients. Molecular markers of primary tumor and variability of patient's microenvironment

Background: il trattamento del cancro alla mammella è cambiata radicalmente negli ultimi due decenni, si è passati dalla mastectomia radicale alla chirurgia conservativa. La dissezione linfonodale ascellare è stata sostituita da una procedura meno invasiva, la biopsia del linfonodo sentinella, che ha una minore morbilità rispetto alla linfadenectomia ascellare e viene utilizzata per valutare lo stato dei linfonodi. I pazienti con linfonodo sentinella positivo subiscono uno svuotamento di linfonodi ascellari di I e II livello. Questa operazione è gravata da una rilevante morbilità postoperatoria, come linfedema dell'arto superiore, complicanze della ferita, danno ai nervi, mobilità limitata, dolore neuropatico, intorpidimento e perdita sensoriale. Le metastasi linfonodali ascellari nel carcinoma mammario in stadio T precoce sono spesso confinate all'interno del linfonodo sentinella, che non offre informazioni sulla presenza di metastasi addizionali ai linfonodi non sentinella, 40% -70% dei casi . L'identificazione di questi pazienti a basso rischio di metastasi ai linfonodi non sentinella eviterebbe a questi pazienti una dissezione ascellare inutile. Al fine di evitare uno svuotamento ascellare non necessario è indispensabile trovare uno strumento diagnostico in grado di identificare i pazienti con linfonodo sentinella positivo a basso rischio di metastasi ai linfonodi non sentinella. Materiale e metodi: Abbiamo valutato se l’espressione di un panel di geni in pazienti con carcinoma mammario sottoposte a biopsia del linfonodo sentinella presso la nostra U.O, potesse predire le metastasi ai linfonodi non sentinella e l'influenza di polimorfismi di geni correlati a vie infiammatorie e angiogenetiche (IL8 rs4073, VEGF-2 rs11133360) sullo stato linfonodale ascellare e per predire le metastasi ai linfonodi non sentinella. Marcatori molecolari: • Studio pilota: abbiamo calcolato l'espressione di un pannello di geni in 24 campioni di tessuto congelato da pazienti selezionati con linfonodo sentinella positivo sottoposte anche a linfadenectomia ascellare, 12 con linfonodi non sentinella negativi e 12 con linfonodi non sentinella positivo. Abbiamo personalizzato i nostri array di PCR che includono i geni delle sequenze PCR del cancro della mammella RT2 Profiler (SABiosciences) e 4 geni (NDUFA7, MERTK, FN1, PSMB6) ottenuti da uno studio precedente di microarray eseguito nel nostro dipartimento (non pubblicato). Questi 88 geni sono coinvolti nella classificazione del tumore, nella trasduzione del segnale e in percorsi come l'angiogenesi, l'adesione, la proteolisi, il ciclo cellulare e l'apoptosi. • Studio di validazione: abbiamo valutato l'espressione di cinque geni significativi (THBS1, IGF1, ERBB2, GRB7, MGMT), ottenuti dal precedente esperimento pilota, in 171 campioni di tessuto congelato da carcinoma mammario di paziente, sottoposte a chirurgia mammaria e biopsia del linfonodo sentinella per cancro alla mammella, tra il 2000 e il 2013 nella nostra UO, con RT-PCR. Polimorfismi (IL8 rs4073 VEGFr-2 rs11133360): Il DNA genomico è stato isolato dal sangue periferico / buffy coat di 234 pazienti. Sono stati utilizzati da 10 a 20 ng di DNA di ciascun paziente per i saggi di genotipizzazione di TaqMan SNP (Applied Biosystems). La genotipizzazione è stata eseguita mediante Real Time PCR utilizzando la discriminazione allelica nel sistema PCR RT 7300 (Applied Biosystems). I dati post-esecuzione sono stati forniti dal software SDS 7300 (Applied Biosystems) e le chiamate automatiche sono state assegnate con una qualità analizzata del 99,8% circa. Risultati: Marcatori molecolari: THBS1 (p: 0,0012) e IGF1 (p: 0,05) sono statisticamente differentemente espressi tra pazienti con linfonodi sentinella positivi e linfonodi non sentinella negativi e pazienti con linfonodi sentinella positivi e linfonodi non sentinella positivi. ERBB2, GRB7, MGMT sono differentemente espressi tra i due gruppi, ma in maniera non statisticamente significativa (p: 0,07; p: 0,07; p: 0,08), ma li abbiamo inclusi nello studio di convalida. La RT-PCR per THBS1, IGF1, ERBB2, GRB7, MGMT è stata eseguita in 171 pazienti. Solo il livello di GRB7 è espresso in modo diverso nel gruppo di interesse della nostra ricerca. Il livello di espressione medio di GRB7 in pazienti con linfonodo sentinella positivo e linfonodo non sentinella negativo era 3,14 ng / ul, nel gruppo di pazienti con linfonodo sentinella positivo e svuotamento ascellare positivo il livello mediano era di 6,76 ng / ul (p: 0,014). Gli altri geni (IGF1, MGMT, ERBB2, THBS1) hanno un'espressione simile in questi gruppi di pazienti L'invasione vascolare (IV) e l'analisi della sezione congelata sono fattori predittivi dello stato delle NSNL sull'analisi di regressione logistica univariata (p <0,05). L'analisi di regressione logistica multivariata ha confermato che GRB7 è un fattore predittivo indipendente di stato dei linfonodi non sentinella in pazienti con linfonodo sentinella positivo (p: 0,017). Inoltre, l'analisi della sezione congelata si è dimostrata statisticamente diversa nei due gruppi sull'analisi multivariata (p: 0,047). La discriminazione della multivariata è stata valutata con l'area sotto la curva ROC ricevente e l'AUC è 0,77. Polimorfismi (IL8 rs4073 VEGFr-2 rs11133360): Abbiamo considerato due modelli per entrambi i polimorfismi: dominante e recessivo. Quando abbiamo analizzato la correlazione tra lo stato genotipo e lo stato dei linfonodi non sentinella in pazienti con linfonodi sentinella positivi, non sono stati ottenuti risultati statisticamente significativi per entrambi i modelli. I due polimorfismi studiati non sono predittivi dello stato ascellare in pazienti con linfonodo sentinella positivo, ma solo IL8 rs4073, nel modello recessivo, è significativamente differente tra pazienti con metastasi ascellari (N +) e pazienti con stato ascellare negativo (N0) Conclusione: I nostri dati suggeriscono che il livello di espressione di GRB7 potrebbe essere uno strumento predittivo dello stato ascellare in pazienti con linfonodo sentinella positivo e potrebbe aiutare il chirurgo a decidere la migliore chirurgia in questo gruppo di pazienti. I polimorfismi studiati non sono predittivi dello stato di NSNL, ma una donna omozigote per l'allele A del polimorfismo IL-8 rs4073 ha una probabilità di 2,28 volte maggiore rispetto al resto della popolazione malata di sviluppare metastasi ascellari se affetta da tumore della mammella.