The immune system of cetaceans and their interaction with dolphin morbillivirus

L’immunologia dei mammiferi marini è un campo relativamente recente degli studi scientifici e il suo monitoraggio ha un ruolo importante sulla gestione individuale e di gruppo di questi animali, nonché un crescente valore come indicatore della salute ambientale: i cetacei sono infatti considerati sentinelle ambientali. Le conoscenze attuali relative al sistema immunitario dei cetacei e alla sua funzione sono però incomplete. Questo studio si prefigge dunque lo scopo di implementare le conoscenze sulla risposta immunitaria in condizioni di normalità nei cetacei spiaggiati lungo le coste italiane al fine di fornire una base-line utile per valutare lo stato immunitario di tursiope (Tursiops truncatus) e stenella (Stenella coeruleoalba), specie maggiormente presenti nei nostri mari ed incluse in alcune convenzioni internazionali come specie ad elevata protezione. La selezione degli animali da inserire nello studio si è bastata sulla disponibilità di campioni di milza, timo e tessuto linfonodale dei vari soggetti, sulle modalità (in formalina o congelati) e sullo stato di conservazione degli stessi; sono stati infatti preferiti tessuti di animali il cui campionamento è avvenuto dell’arco delle 48 ore dal decesso al fine di ridurre il più possibile le alterazioni post-mortali. Successivamente gli animali sono stati divisi in gruppi sulla base delle informazioni ottenute dal segnalamento come specie, sesso, classe di età e ambiente di provenienza, sull’esito di indagini virologiche, microbiologiche, parassitologiche e tossicologiche, qualora eseguite, e la causa e/o meccanismo del decesso. Sulle sezioni di linfonodo ottenute dai campioni in formalina è stata effettuata la colorazione di base ematossilina-eosina e le colorazioni immunoistochimiche usando gli anticorpi di seguito elencati: Monoclonal Mouse Anti-Human CD3 per l’identificazione dei linfociti T, Monoclonal Mouse Anti-Human CD20 per l’identificazione dei linfociti B maturi e Monoclonal Mouse Anti-Human HLA-DR Antigen, Alpha-Chain per l’identificazione del complesso maggiore di istocompatibilità di tipo II. Si è inoltre provveduto a validare mediante la tecnica del Western Blotting gli anticorpi che precedentemente sono stati usati in immunoistochimica (IHC). L’uso di questi anticorpi era validato solo per l’uomo ed alcuni animali domestici (cane e gatto), ma non nelle specie di nostro interesse quali tursiope e stenella. Sono stati inoltre testati tramite IHC, con gli anticorpi sopra citati, i tessuti linfoidi di cetacei spiaggiatesi lungo le coste delle isole Canarie usati come controllo negativo in quanto morti verosimilmente a causa di collisioni con barche/navi. Infine è stata effettuata un’analisi semi quantitativa dei campioni mediate l’acquisizione dei vetrini tramite l’acquisitore D-SIGHT e una conta manuale del numero di cellule positive per ogni anticorpo in 10 campi ad ingrandimento 40x ritenuti rappresentativi di tutto l’organo e su questi dati è stata eseguita un’analisi statistica con il metodo del T TEST. L’analisi statistica non ha mostrato alcuna correlazione significativa tra le numerose variabili prese in esame e l’espressione delle diverse popolazioni linfocitarie. Analisi future dovranno essere volte ad analizzare il rapporto tra CD4 e CD8 al fine di capire l’effetto dei principali patogeni immunodepressori, quali il dolphin morbillivirus, sulle sub-popolazioni di linfociti T. Sarebbe inoltre importante comparare i dati ottenuti sul sistema immunitario con quelli ottenuti dagli stessi campioni per quanto riguarda la ricerca di agenti inquinanti ambientali per capirne in reale ruolo sulla salute dei mammiferi marini presenti nei nostri mari. La ricerca non si è però focalizzata solamente sulla risposta immunitaria degli ospiti ai vari patogeni, ma ci siamo concentrati sul patogeno più importante tra quelli che al momento causano morie tra i mammiferi marini: il dolphin morbillivirus (DMV). In particolare, a partire da tessuti di un esemplare DMV positivo di balenottera comune (Balaenoptera physalus) spiaggiatesi lungo le coste italiane nell’ottobre 2013 è stato possibile sequenziare completamente i geni P/V/C (1520 bp), M (1007 bp), N (1573 bp), F (1659 bp) ed H (1814 bp) codificanti rispettivamente per la fosfoproteina e due fattori di virulenza (V e C), per la proteina di matrice, la nucleoproteina, la proteina di fusione e l’emoagglutinina. Le sequenze complete dei geni sopracitati cono state depositate in GenBank (GenBank provisional Acc. No. KU977449, KU977450, KU977451, KU977452 e KU977453). L’isolamento del virus nei tessuti dell’animale è stato possibile grazie a tecniche biomolecolari quali RT-PCR con uso di primers disegnati ad hoc e clonaggio mediante vettore plasmidico. I cambiamenti nucleotidici, e di conseguenza amminoacidici, di ogni singolo gene sono stati successivamente analizzati e confrontati con il genoma virale delle precedenti epidemie. È stato poi possibile eseguire uno studio della struttura terziaria del virus per visualizzare come questi cambiamenti puntiformi avessero un ruolo nel cambiamento strutturale delle proteine stesse. Sulla base di tale lavoro di sequenziamento abbiamo provveduto a individuare una tecnica diagnostica opportuna utilizzabile anche su animali di difficile gestione (difficoltà di campionamento e di conservazione opportuna dei campioni) approntando una nested RT-PCR che permetta l’identificazione univoca di un frammento di genoma di 200 bp corrispondente ad una parte altamente conservata del gene H. Questa tecnica permette, qualora il genoma del virus sia particolarmente frammentato a causa del cattivo stato di conservazione dell’animale, di verificare la positività a DMV del tessuto in analisi, di isolare parte del virus, altrimenti difficilmente isolabile, e di poterlo sequenziare. Tale tecnica è stata poi utilizzata con successo per l’identificazione e il sequenziamento di DMV nei tessuti di 3 capodogli spiaggiatisi a Vasto nel 2014 (GenBank Acc. No. KU886570). È possibile dunque affermare che il DMV sta colpendo specie che fino a poco tempo fa erano considerate specie non sensibili all’infezione, quali balenottera comune e capodoglio. Gli animali di queste nuove specie colpiti dall’infezione sono prevalentemente animali giovani o addirittura cuccioli e l’aver isolato il virus negli organi di un feto conferma la possibilità di trasmissione dello stesso per via verticale. Visto il salto di specie effettuato dal virus, i suoi cambiamenti puntiformi nella sequenza genomica e un’incidenza di positività del virus nelle specie target del 19% nel 2015 possiamo affermare di essere in una situazione in cui il virus è endemico nel Mar Mediterraneo con conseguente aumento della pressione infettante. Gli studi futuri in questo ambito saranno volti a capire in maniera più precisa il ruolo dei singoli cambiamenti aminoacidici e la loro influenza sulla virulenza e patogenicità del virus grazie all’impiego della cristallografia, a studiare la struttura del recettore cellulare del virus, il CD150, per capire la sua reale interazione con il virus, e a cercare di capire la reale rilevanza del DMV nell’ecologia dell’intera popolazione di balenottera comune nel mediterraneo.