Development of high-throughput technologies for species of veterinary relevance. Investigation of the genetic basis of mandibular prognathism in the European seabass (Dicentrarchus labrax)

Negli ultimi 20 anni, l’allevamento di specie ittiche marine ha avuto un rapido incremento, grazie principalmente al continuo sviluppo e miglioramento delle tecniche di produzione. Rimangono comunque ancora da risolvere diversi problemi nei processi di produzione, come ad esempio la presenza di malformazioni scheletriche, l'elevata mortalità delle larve o la suscettibilità allo stress e le malattie. Le anomalie scheletriche nei pesci d'allevamento incidono in maniera rilevante anche sul benessere e la salute degli animali, causando notevoli perdite economiche per gli allevatori. Tuttavia, il costante progresso delle tecniche di biologia molecolare e di genetica hanno permesso di ampliare notevolmente le nostre conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di molti caratteri produttivi di rilevanza economica nelle specie allevate. L'obiettivo principale di questo studio è stato quello di indagare le basi genetiche del prognatismo mandibolare (MP), una malformazione scheletrica presente, con una moderata incidenza, negli allevamenti intensivi di branzino (Dicentrarchus labrax). A questo scopo, abbiamo applicato un particolare protocollo di analisi, il 2bRAD (type IIB endonucleases restriction-site associated DNA), ampiamente utilizzato per lo sviluppo di marcatori genetici affiancato a tecniche di sequenziamento massivo NGS (Next Generation Sequencies). L'affidabilità e la riproducibilità del protocollo 2bRAD è stata prima testata su due organismi di una certa rilevanza veterinaria: il tonno pinna gialla (Thunnus albacares), un pesce importante sia dal punto di vista biologico che economico, e la Listeria monocytogenes, un batterio patogeno che può causare la listeriosi. Nel tonno pinna gialla sono stati identificati 6772 marcatori SNP (Single Nucleotide Polymorphism) in popolazioni campionate su tutto l’areale di distribuzione negli Oceani Atlantico, Indiano e Pacifico. L’analisi discriminante delle componenti principali (DAPC) ha permesso di rilevare la presenza di popolazioni distinte di tonno pinna gialla nei tre Oceani. Questi risultati hanno dimostrato quindi l'efficacia del 2bRAD nello studio della divergenza genetica in un pesce marino ad alto potenziale di dispersione. Un totale di 1279 loci SNP sono stati identificati per Listeria monocytogenes, e questo lavoro rappresenta un primo esempio di applicazione di tecnologie “RAD-like” nel campo della genetica microbica. I risultati ottenuti suggeriscono che il 2bRAD potrebbe rivelarsi uno strumento estremamente utile per l'epidemiologia molecolare, così come in altri settori di studio come la filogenesi, la tassonomia, la genetica di popolazione e la salute pubblica. Nel lavoro sul prognatismo mandibolare del branzino, è stata inizialmente sviluppata una mappa di linkage ad alta densità utilizzata per la mappatura dei QTL potenzialmente associati alla patologia; successivamente è stato fatto uno studio di associazione (GWAS) scansionando l’intero genoma di branzino per trovare marcatori SNP putativamente associati al prognatismo. Sono stati utilizzati 298 esemplari giovanili in totale, di cui 148 appartenenti a quattro famiglie full-sib. Un totale di 7362 marcatori SNP sono stati genotipizzati in più del 80% della popolazione sperimentale. Tre QTL significativi sono stati rilevati per il prognatismo utilizzando un’analisi di regressione half-sib. Il primo è stato mappato sul gruppo di linkage LG18, il secondo su LG20 e il terzo sul gruppo di linkage LG22; ogni QTL spiegava circa l’11-13% della variazione fenotipica. Due SNP associati al MP sono stati identificati con l'analisi GWAS. I marcatori candidati sono stati individuati sul cromosoma ChrX e sul cromosoma Chr17, in stretta vicinanza ai due QTL più significativi. In particolare, il marcatore SNP su Chr17 è posizionato all'interno della regione codificante del gene Sobp, che svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo craniofacciale. Inoltre, l’analisi dei geni differenzialmente espressi nei branzini prognati ha evidenziato lo “sviluppo del sistema nervoso" come un pathway cruciale nella formazione del MP. In particolare, Zic2, un gene chiave per la morfogenesi craniofacciale nelle specie modello, risulta significativamente sotto-espresso negli animali affetti da prognatismo. Il lavoro svolto in questo studio quindi, integrando la trascrittomica e l’analisi di marcatori molecolari sviluppati sull’intero genoma, fornisce validi risultati per comprendere meglio i meccanismi molecolari che sono alla base dell’insorgenza del prognatismo mandibolare nei branzini di allevamento.