Studio della modulazione dell'espressione genica mediata dai microRNA in cellule infettate da citomegalovirus umano

Introduzione: Ad oggi l’attività di pochi microRNA (miRNA) di citomegalovirus umano (HCMV) è stata studiata, e correlata con il ciclo re plicativo virale e con l’evasione della risposta immunitaria. Scopo di questo studio è stata la caratterizzazione degli effetti dell’infezione e dei miRNA di HCMV sull’espressione dei miRNA e dell’ mRNA umani della cellula ospite dopo l’infezione,e l’dentificazione e validazione dei target cellulari dei miRNA diHCMV. Metodi: É stata effettuata un’analisi mediante microarray per valutare la cinetica di espressione temporale 4, 8, 24, 48, 72 h.p.i. dei miRNA virali e cellulari, e dell’mRNA cellulare in un esperimento di infezione di cellule MRC-5 infettate con il ceppo Towne HCMV ad una MOI 2. mRNA e miRNA, cellulari e virali, differenzialmente espressi, sono stati selezionati secondo l' area della regione delimitata dai profili di espressione relativi al controllo e i casi post infezione. L’identificazione dei target dei miRNA di HCMV è stata fatta mediante un algoritmo di predizione computazionale, basato sulla complementarietà di sequenze, e la correlazione dell’espressione dell’mRNA con l’espressione dei miRNA; la validazione dei target dei miRNA hcmv-miR-US25-2-3p e hcmv-miR-US25-2-5p è stata effettuata mediante saggi di luciferasi e western blot. Gli effetti di hcmv-miR-US25-2-3p sullo splicing alternativo PTBP1-dipendente sono stati studiati mediante real-time RT-PCR . L'effetto positivo di hcmv-miR-US25-2-3p sulla replicazione di HCMV è stato verificato in un modello knock- out per hcmv- miR-US25-2-3p. Risultati: La maggior parte dei miRNA di HCMV è espressa fin dai primi stadi o entro 24 ore dopo l'infezione, in particolare, hcmv-miR-US25-2-3p è uno dei più espressi a partire da 4 ore dopo l' infezione e continua ad accumularsi nel tempo. L’espressione dei miRNA cellulari durante l'infezione da HCMV ha rivelato 68 miRNA cellulari differenzialmente espressi dopo l'infezione che sono stati raggruppati, con analisi di clustering, in 6 cluster di miRNA cellulari, coinvolti nella proliferazione e differenziazione cellulare e caratterizzati da cambiamenti coerenti nel profilo di espressione durante il decorso dell'infezione. I target predetti sulla base della complementarietà di sequenza di hcmv-miR-US25-2-3P PTBP1 , HDAC11 , HDAC4 e IFI30, sono significativamente inibiti dal miRNA sia nel saggio di attività della luciferasi che in Western Blot, mentre i target individuati mediante la correlazione di espressione di hcmv-miR-US25-2-5p, CD68 e Fas, non sono stati confermati da test di attività della luciferasi e dall’analisi dell’espresione proteica mediante Western Blot. È stata dimostrata l’inibizione di hcmv-miR-US25-2-3p sullo splicing alternativo PTBP1-dipendente dei trascritti della cellula ospite. Infine, il knock-down di hcmv-miR-US25-2-3p diminuisce la replicazione di HCMV. Conclusione: Un'analisi integrata dei miRNA virali e cellulari e dell’ mRNA della cellula ospite, e l'identificazione di nuovi geni target per hcmv-miR-US25-2-3p coinvolti nella regolazione epigenetica dell'espressione genica virale e cellulare e nella risposta immunitaria innata ha permesso una maggiore comprensione della complessa interazione tra HCMV e cellula ospite nel corso di infezione.