Signaling and transcriptomics at the degenerating-regenerating neuromuscular junction

La giunzione neuromuscolare è una regione anatomica altamente specializzata in cui i segnali elettrici che corrono lungo l’assone del motoneurone sono convertiti in segnali chimici, che vengono a loro volta riconosciuti dalle cellule muscolari causandone la contrazione. E’ composta dal terminale assonico del motoneurone, dalle cellule di Schwann perisinaptiche che avvolgono quest’ultimo, dalla fibra muscolare e dalla lamina basale. La giunzione neuromuscolare non è protetta da barriere anatomiche e pertanto può essere bersaglio di differenti patogeni come virus, batteri, tossine. Inoltre la giunzione può essere affetta da diverse patologie quali la sclerosi laterale amiotrofica o la Sindrome di Guillain-Barrè di origine autoimmune. Per questi motivi e per la sua funzione fisiologica essenziale per la vita degli animali, non sorprende dunque la capacità della giunzione neuromuscolare di rigenerare e recuperare la sua funzionalità a seguito di differenti tipi di danno. Questa abilità si è mantenuta durante l’evoluzione animale, e differenzia le sinapsi del sistema nervoso periferico da quelle del centrale, che non hanno invece capacità rigenerativa. In seguito a denervazione le cellule di Schwann perisinaptiche mostrano una grande plasticità, de-differenziando ed iniziando a proliferare. Esse partecipano attivamente ai processi di rigenerazione nervosa, contribuendo al rilascio di diversi fattori in grado di agire sul terminale nervoso degenerato promuovendone la ricrescita ed il pieno recupero della sua funzionalità. Sono ancora poco conosciuti gli eventi intra- ed inter-cellulari che avvengono alla giunzione durante la degenerazione e soprattutto quelli che governano il processo rigenerativo del terminale nervoso. A tale scopo, nel nostro laboratorio è stato messo a punto un approccio sperimentale innovativo che permette di studiare la degenerazione e rigenerazione della giunzione neuromuscolare sfruttando il meccanismo d’azione di una neurotossina presinaptica animale, α-Latrotoxin, presente nel veleno dei ragni del genere Latrodectus. Questa tossina agisce selettivamente a livello della membrana presinaptica del motoneurone, inducendo un danno acuto e localizzato del terminale nervoso. Il terminale degenera rapidamente ma in breve tempo, in seguito alla rimozione dei detriti neuronali da parte delle cellule di Schwann, è in grado di ricrescere e di riacquisire una piena funzionalità. L’azione di tali neurotossine rappresenta quindi un sistema appropriato e controllato per indurre una degenerazione acuta, localizzata e reversibile del terminale nervoso, evitando il coinvolgimento di molti tipi cellulari e mediatori dell’infiammazione come accade nel corso della degenerazione indotta da cut/crush del nervo sciatico, tradizionalmente utilizzato fino ad oggi. Questo approccio può dunque aiutare a definire i meccanismi molecolari ed identificare i segnali intra- ed inter-cellulari alla base della degenerazione e rigenerazione nervosa. Con lo scopo di identificare molecole in grado di promuovere la rigenerazione del terminale nervoso, abbiamo messo a punto un protocollo che ci ha permesso di ottenere per la prima volta un’analisi trascrizionale a livello di giunzione neuromuscolare durante le diverse fasi di degenerazione e rigenerazione del terminale nervoso periferico in seguito ad intossicazione con α-latrotoxin. Abbiamo isolato e sequenziato da un numero adeguato di giunzioni RNA codificanti e non. Tra i diversi trascritti abbiamo selezionato quelli che presentavano un basso valore di espressione nel controllo, un aumento durante le fase rigenerativa per poi tornare ad un livello basale quando la rigenerazione è conclusa. Tra questi abbiamo approfondito lo studio della chemochina CXCL12, dimostrando che viene prodotta dalle cellule di Schwann terminali durante la degenerazione nervosa, e che l’iniezione intraperitoneale di un anticorpo neutralizzante comporta un ritardo nel processo rigenerativo. Inoltre abbiamo dimostrato che questa chemochina è in grado di promuovere la crescita dei neuriti di motoneuroni in coltura. Questi risultati suggeriscono come CXCL12 sia un importante fattore rilasciato dalle cellule di Schwann perisinaptiche con un ruolo cruciale nei processi rigenerativi del terminale nervoso. Parallelamente abbiamo indagato quali potessero essere i segnali di allarme rilasciati dal terminale nervoso in degenerazione in grado di attivare le cellule di Schwann e di promuovere la rigenerazione nervosa. Abbiamo dimostrato che l’ATP viene rilasciato da neuroni in seguito ad intossicazione con α-latrotoxin, ed è in grado di attivare nelle cellule di Schwann diverse vie di segnalazione intracellulari quali il calcio, l’AMP ciclico, ERK1/2, CREB, importanti per il recupero della funzionalità nervosa in seguito a danno. I dati presentati in questa tesi identificano l’ATP come importante molecola segnale nella comunicazione tra il terminale nervoso in degenerazione e le vicine cellule di Schwann perisinaptiche, ed estendono tale ruolo anche ad altre forme di degenerazione del terminale nervoso presinaptico.