Novel polysaccharide anti-tumour drug delivery system for active targeting and controlled release to breast cancer bone metastases

RIASSUNTO Nell'ultima fase della malattia, i pazienti che hanno il cancro al seno spesso sviluppano metastasi ossee, una delle principali cause di morte legata al cancro tra le donne nel mondo. Il trattamento comune attualmente utilizzato clinicamente include l'agente anti-neoplastico paclitaxel (PTX) e il bisfosfonato alendronato (ALN). Il paclitaxel è un farmaco anti-neoplastico a quale l’effetto citotossico è attribuito principalmente alla sua capacità di impedire la depolimerizzazione dei microtubuli. La stabilizzazione dei microtubuli mitotici interrompe le funzioni che, in sequenza, blocca la divisione cellulare. Il paclitaxel è approvato per il trattamento del cancro dell'ovaio, della mammella, e del cancro ai polmoni in fase avanzata. Tuttavia, il farmaco anti-tumoure è altamente idrofobico e, di conseguenza, è scarsamente solubile in acqua. Inoltre, la formulazione di paclitaxel attualmente utilizzata in ambito clinico, nota come Taxolo, contiene il farmaco anti-neoplastico disciolto in una miscela di Cremophor EL ed etanolo per aumentarne la solubilità. Tuttavia, la somministrazione di Cremophor EL causa grave dose-limitante tossicità, come ipersensibilità e neuropatia. Infine, l'agente chemioterapeutico soffre di scarsa selettività verso i tumouri, e risulta in danneggiare le cellule normale e sane. Come risultato, molti sforzi sono stati compiuti per lo sviluppo di nuova formulazione di paclitaxel mediante polimerici biocompatibili e biodegradabili. Inoltre, metastasi ossee sono fonte di notevole preoccupazione per i pazienti con carcinoma della mammella in fase avanzata. I pazienti possono affrontare sfide supplementari al cancro come il declino della loro salute del squelette, e contribuisce a una manifesta diminuzione della qualità di vita e sopravvivenza. Alcuni bisfosfonati sono stati valutati in pazienti con metastasi ossee da tumoure primario della mammella, e più particolarmente l'alendronato, al fine di ridurre riassorbimento osseo e progressione del tumore. Il presente progetto mira allo sviluppo di un nuovo nano-sistema di veiculazione di farmaco al sito target, ed il rilascio controllato di farmaco anti-tumoure. Il modello sviluppato è un coniugato polimero-farmaco dove il farmaco anti-tumoure Paclitaxel - utilizzato per trattare il cancro della mammella - e l'alendronato, sono collegati ad un supporto polimerico naturale, il Pullulano, attraverso un distanziatore. Il coniugato polimero-farmaco, progettato per il rilascio controllato in particolare condizione fisiologiche, utilizza due meccanismi principali per il rilascio, compreso un idrolisi enzimatica e un idrolisi non-enzimatica. La scelta del distanziatore tra il polimero e il farmaco è stato fatta in modo che il rilascio del farmaco si verifica solo una volta che il sistema raggiunge le metastasi ossee, rilascio utilizzando una idrolisi enzimatica prima. Quando i coniugati polimero-farmaco sono elaborati per tumoure, il legame tra il farmaco e il polimero deve essere necessariamente stabile in condizioni fisiologiche fino a quando raggiunge il bersaglio tumourale. Il veicolo colloidale è stato progettato per migliorare la biofarmaceutica e le proprietà terapeutiche del farmaco anti-tumoure paclitaxel, aumentando la solubilità in acqua e l'individuazione del tumoure stesso. Il bisfosfonato alendronato è stato scelto come agente di mira a conferire una elevata affinità del coniugato verso la struttura di apatite di metastasi ossee, sfruttando la forte proprietà di grande affinità per l'osso dei bisfosfonati, insieme con il micro-ambiente di metastasi ossee, al fine di garantire un rilascio selettivo e l'accumulo dei farmaci anti-tumouri nel punto di azione desiderato; le metastasi ossee. Primo, gli studi preliminari sono state eseguiti studiando l'influenza del tempo di ossidazione del Pullulano sulla sua architettura (peso molecolare e polydispersivity). Il Pullulano è stato modificato per ossidazione con periodato in vista di ottenere un polisaccaride altamente reattivo verso le ammine. Dagli risultati di studi preliminari, si è scelto di preparare un Pullulano ossidato a 30%. Il distanziatore GlyGlyProNle sensibile alla Catepsina K è stato poi sintetizzato mediante il metodo sintesi di peptidi in fase solida (SPPS) usando la strategia Fmoc. Pactitaxel è stato accoppiato con il distanziatore sensibile all'enzima, ed con un distanziatore auto-immolative tramite una sintesi in sei passi, per formare un profarmaco. Consecutivamente, il targeting delle ossa è stato eseguito con l’alendronato, PEGilato tramite un acido carbossilico attivato con N-idrossisuccinimide. Infine, i due "profarmaci" sono stati successivamente ancorati al backbone del polisaccaride via formazione di base di Schiff e amminazione riduttiva. Una volta che il coniugato polimero-farmaco, chiamato Pull-PTX-ALN, è stato completamente sintetizzato, caratteristiche chimico-fisiche del colloide sono state investigate. Tutti gli coniugati sintetizzati sono stati caratterizzati in termine di contenuto in PTX e ALN, purezza e stabilità in condizioni fisiologiche. Questi coniugati hanno mostrato il rilascio del farmaco anti-neoplastici solo in presenza di catepsina K a pH 5,5 , confermando che il tipo di legame scelto consente il rilascio del farmaco sotto precise condizioni fisiologiche, solo nel ambiente delle metastasi ossee. Il coniugato polimero-farmaco, veiculando PTX e ALN, anche presenta un'alta affinità per l’idrossiapatite in vitro, dimostrando il potenziale del alendronato come agente di mira. L’attività citotossica era simile al farmaco libero o in combinazione con alendronato in linea cellululare 4T1 (linea cellulare adenocarcinoma mammario in murine), MDA-MB-231 BM (linea cellulare del adenocarcinoma mammario umano da metastasi ossee) e SAOS-2 (linea cellulare di osteosarcoma). Le proprietà anti-angiogeniche dell'alendronato in combinazione con paclitaxel sono state valutate con HUVEC (cellule umane endoteliali di vena ombelicale), anche per i coniugati polimero-farmaco. Il PTX e ALN insieme, nella loro forma libera, e coniugati al Pullulano, hanno presentato un'inibizione notevole della proliferazione e della migrazione delle cellule HUVEC. Inoltre, una riduzione della formazione di tubi capillari di circa 40-50 %, è stata osservata dopo 8 ore di incubazione con la linea cellulare.