"New implications for the LKB1/AMPK pathway: regulation of apoptosis and circadian rhythm"

La Leucemia linfoblastica acuta (LAL), il tumore pediatrico più diffuso, è una patologia delle cellule linfopoietiche caratterizzata da una proliferazione clonale di blasti originati dai precursori linfoidi bloccati a stati differenziativi precoci. Ad oggi un miglioramento della prognosi dei pazienti affetti da LAL è stato portato dallâ introduzione di trattamenti differenziati sulla base del rischio di ricaduta e da protocolli di cura più intensi. Le terapie attualmente usate permettono di ottenere una sopravvivenza dell' 80% a 5 anni dalla diagnosi, tuttavia esiste ancora circa un 20% di pazienti che presenta rischio di ricaduta precoce e resistenza alla terapia. Risulta dunque fondamentale identificare nuovi target terapeutici e biomarcatori delle cellule leucemiche al fine di sviluppare trattamenti di supporto innovativi e di individuare terapie più specifiche, migliorando la risposta alle terapie e riducendone la loro tossicità. Per perseguire questo obiettivo, per prima cosa tramite la tecnica di Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) abbiamo mappato il profilo fosfoproteomico di pazienti pediatrici BCP-LAL. Questa tecnica rappresenta uno strumento potente per studiare il profilo proteico delle vie di trasduzione del segnale con lo scopo di identificare nuovi marker prognostici e target terapeutici. Con la metodica degli RPPA è possibile misurare il livello di attivazione/espressione di un ampio numero di proteine di segnale e di identificare alterazioni nei punti chiave dei network cellulari. Questo risulta essere un punto di partenza potenziale per lo sviluppo di nuovi farmaci e/o l' ideazione di nuovi regimi terapeutici. Lo scopo principale del mio dottorato di ricerca è stato la scoperta di nuovi biomarcatori e target terapeutici coinvolti nel processo leucemico partendo dallo studio del profilo fosfoproteomico di 118 pazienti pediatrici BCP-LAL attraverso la tecnica di RPPA. Abbiamo analizzato i livelli di espressione/attivazione di 92 differenti proteine/fosfoproteine di segnalazione chiave. La correlazione sulle vie di trasduzione attivate con la risposta alla terapia e con le caratteristiche genetiche dei pazienti ci ha permesso lâ identificazione nuovi biomarcatori che, una volta validati in un gruppo allargato di campioni di LAL-B, potranno permettere una migliore stratificazione dei pazienti e potranno essere usati per lo sviluppo di cure paziente-specifiche. In particolare, in pazienti a prognosi infausta, abbiamo osservato un aumento dellâ attivazione/espressione di diverse vie di trasduzione del segnale coinvolte nella proliferaziione cellulare. In primo luogo, pazienti leucemici con traslocazione del gene MLL presentano lâ iperfosforilazione di BCL-2 conseguente allâ attivazione di AMPK, indicando che AMPK possa essere responsabile dellâ inibizione dellâ apoptosi in questi pazienti e quindi potrebbe essere un nuovo target terapeutico. Il secondo risultato osservato è una up-modulazione dell' attività di LCK nei pazienti con scarsa risposta al trattamento con Prednisone. Questa tirosina-chinasi potrebbe essere down-modulata tramite lâ utilizzo di inibitori utilizzati in clinica e, quindi, potrebbe essere considerata per ulteriori studi al fine di identificare terapie addizionali per i pazienti resistenti al Prednisone. Da questa analisi fosfoproteomica è emersa, inoltre, unâ associazione tra gli elevati livelli di CICLINA E e lâ incidenza di ricaduta. In aggiunta la CICLINA E è risultata essere maggiormente espressa in pazieni con ricaduta precoce, generalmente associata ad una prognosi sfavorevole. Successivamente abbiamo approfondito, come prima cosa, il significato funzionale dellâ attivazione di AMPK nei pazienti con riarrangiamento del gene MLL. Abbiamo dimostrato che il pathway di AMPK contribuisce direttamente alla sopravvivenza delle cellule BCP-LAL MLL-riarrangiate, suggerendo AMPK come nuovo target terapeutico per questo tipo di leucemia. Infatti lâ inibizione di AMPK, tramite lâ utilizzo del suo inibitore commerciale (Compound C), porta a morte cellulare attraverso la via intrinseca di apoptosi sia nelle linee cellulari sia in colture cellulari primarie. Inoltre il Compound C ha azione sinergica con farmaci utilizzati in clinica per la terapia di pazienti pediatrici LAL. Il secondo scopo del mio dottorato di ricerca è stato quello di focalizzarmi su LKB1, principale attivatore di AMPK, risultato essere anchâ esso iperfosforilato nello studio di proteomica. LKB1 è stato trovato overespresso a livello proteico, ma non a livello di mRNA nelle leucemie con riarrangiamento del gene MLL. Il suo silenziamento specifico porta ad un blocco del ciclo cellulare in fase S e conseguente apoptosi. Molto interessante è stata la scoperta che LKB1 risulta essere iperfosforilato nelle cellule in mitosi, con localizzazione centrosomica. Questo data apre la possibilità che LKB1 possa avere un ruolo chiave nella regolazione del ciclo cellulare tramite la regolazione dellâ allungamento e della stabilità dei microtubuli, probabilmente attraverso il pathway AMPK-MRLC. In aggiunta LKB1 potrebbe avere un ruolo anche nel controllo del danno al DNA nelle leucemie con riarrangiamento del gene MLL, in quanto la sua inibizione porta a catastrofe mitotica. LKB1 è una chinasi molto importante con funzioni note diffuse anche nel metabolismo cellulare e nel ritmo circadiano. Il terzo scopo del mio dottorato di ricerca è stato focalizzare lo studio del ruolo di LKB1 nel ritmo circadiano. Abbiamo scoperto che LKB1 gioca un ruolo chiave nel controllo circadiano, interagendo con le proteine clock. LKB1, infatti, è in grado di fosforilare le proteine circadiane, regolandone funzione e localizzazione cellulare in modo circadiano. Una compresione globale del collegamento molecolare che collega LKB1 e il sistema circadiano può portare a benefici nella terapia tumorale. Per esempio, specifici inibitori o attivatori di LKB1 potrebbero essere più efficaci nella terapia tumorale se somministrati in un particolare momento del giorno (cronoterapia). Nella corso del mio dottorato ho potuto dimostrare che l' identificazione e lo studio funzionale di nuovi biomarcatori aberranti coinvolti nei tumori, possono essere utilizzati per sottolineare il collegamento tra questi con lo scopo ultimo di scoprire nuove efficaci terapie pazienti-specifiche