Glucotoxicity, Protein Glycation and Adipose Tissue Dysfunction

Introduzione: La glicazione è una reazione non enzimatica tra uno zucchero e un gruppo amminico contenuto in molecole come proteine, aminoacidi, DNA, RNA e lipidi. Nella fase iniziale, il gruppo carbonilico del carboidrato riducente condensa con il gruppo amminico libero delle biomolecole formando una glicosil-ammina reversibile, la quale verrà poi convertita in un prodotto più stabile, detto prodotto di Amadori. Nel tempo, tali prodotti possono subire processi di disidratazione, ciclizzazione, ossidazione e riarrangiamenti formando un gruppo polimorfico di composti indicati come prodotti di glicazione avanzata (AGEs). L'accumulo degli AGEs in vivo è considerato il più importante collegamento tra il diabete e la malattia ossidativa. In particolare, il tasso di glicazione potrebbe spiegare le complicanze diabetiche a lungo termine. Tuttavia, la loro presenza a livello del tessuto adiposo ed il loro ruolo nell’adipogenesi e nella funzionalità dell’adipocita, non sono ancora stati del tutto determinati e sono a tutt’oggi un importante e stimolante campo di ricerca. Metodi: In questo progetto, sono state utilizzate cellule 3T3-L1 e cellule della frazione vasculo- stromale isolate dal tessuto adiposo umano allo scopo di costruire un modello in vitro per indagare gli effetti indotti sul differenziamento adipogenico dovuti da una esposizione cronica ad un ambiente inducente la glicazione. Sugli adipociti maturi ottenuti in vitro sono stati eseguite: analisi morfologiche, saggi E.L.I.S.A. per gli AGEs, analisi di espressione di geni coinvolti nel metabolismo lipidico e glucidico, misurazione della capacità di captazione del glucosio ed analisi di immunofluorescenza per RAGE, GLP1r, GLUT4 ed AGEs. È stata inoltre confrontata l'espressione genica ottenuta in vitro, con quella misurata nelle biopsie di tessuto adiposo viscerale e sottocutaneo di 64 soggetti obesi con diabete di tipo 2 o con normale tolleranza al glucosio sottoposti ad intervento di chirurgia bariatrica. In collaborazione con il servizio di Spettrometria di Massa (CNR – IENI, Padova), è stato valutato l'utilizzo della spettrometria per la caratterizzazione delle eventuali modifiche post-traduzionali indotte dalla glicazione. Risultati e conclusioni: È stato osservato, sia mediante immunofluorescenza, sia mediante test E.L.I.S.A., che un ambiente inducente alla glicazione porta effettivamente ad un aumento degli AGEs intracellulari. Analisi preliminari delle colture cellulari, inducono ad ipotizzare che possano esistere alcuni effetti indotti dall’ambiente glicante sull'espressione genica. In condizioni glicanti, è stata osservata un’aumentata espressione di Glut4 e una ridotta captazione di glucosio che suggerisce una probabile influenza degli AGEs sulla traslocazione e/o sulla funzionalità del trasportatore del glucosio. Tale osservazione suggerisce che possa esistere una probabile influenza degli AGEs sulla traslocazione /o sulla funzionalità del trasportatore del glucosio. Nonostante la spettrometria di massa sia una metodica molto sensibile ed abbia alte potenzialità, ha anche alcuni svantaggi: modifiche post traduzionali, siano esse enzimatiche o non-enzimatiche, possono essere contemporaneamente presenti sulla stessa proteina; pertanto, l’incremento di massa totale rifletterà la somma di tutte le modifiche. Lo spettro di un lisato intero, si è dimostrato eccessivamente complesso per poter apprezzare piccole differenze. Risulta pertanto necessaria un’analisi composta da più passaggi in cui, in prima istanza verrà isolata e concentrata una frazione di proteine caratterizzate da uno specifico range di peso molecolare che solo in seguito verrà analizzata mediante spettrometria di massa; suddividendo in questo modo l'intero spettro in piccole parti.