Sterilisation methods for decellularised scaffolds

La mancanza di adeguate procedure di sterilizzazione rappresenta uno dei principali ostacoli per l'adozione nell’ambito clinico di sostituti cardiovascolari composti da materiale xenogenico decellularizzato. Tra i requisiti fondamentali dei metodi di sterilizzazione vi è quello di essere specifico e ottimizzato per l'utilizzo su tessuti animali ed essere privo di eventuali effetti nocivi sulle proprietà funzionali del tessuto di origine. Lo scopo di questo studio è di sviluppare due protocolli per la sterilizzazione di scaffold pericardici decellularizzati: il Protocollo di Sterilizzazione 1, basato su un cocktail di antibiotici/antimicotici (AA) e sul trattamento con acido peracetico (PAA); e il Protocollo di Sterilizzazione 2, basato sull’utilizzo di raggi γ. La valutazione dell'efficacia dei metodi di sterilizzazione proposti ha reso necessaria la progettazione di un rigoroso protocollo di analisi. Quest’ultimo consiste nella verifica della sterilità e nella successiva quantificazione/qualificazione della carica batterica residua. Per valutare l'efficacia di tali protocolli, è stata eseguita una contaminazione controllata (CC) preliminare dei tessuti con batteri Gram+ e Gram-. In seguito, il test di sterilità è stato realizzato, in base alle linee guida della Farmacopea Europea, tramite l’inoculazione specifici di una piccola quantità di campione o della sua soluzione di lavaggio in mezzi di coltura batterici. Un mezzo di coltura torbido è stato considerato indicativo di campioni contaminati, mentre un mezzo trasparente indicava la sterilità del campione. L'identificazione di contaminanti è stata eseguita mediante spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight), mentre la quantificazione dei microorganismi è stata effettuata con il metodo del Most Probable Number (MPN). Questo metodo è stato applicato per valutare entrambi i metodi di sterilizzazione in studio, ma può considerarsi adattato anche ad altre metodologie di sterilizzazione e su altri tessuti. I biomateriali su cui i metodi di sterilizzazione sono stati testati sono pericardi di origine suina e bovina, decellularizzati secondo un protocollo consolidato denominato TRICOL. Il Protocollo di Sterilizzazione 1 consiste nell’incubazione di tessuti con un cocktail di AA comprendenti vancomicina, gentamicina, cefoxitina e anfotericina B per 24 ore a 37 °C, seguita da un trattamento con PAA al 0,05% e lo 0,1% (v/v) per 3h a 27 °C. Il secondo protocollo sviluppato (Protocollo di Sterilizzazione 2) consiste nell'applicazione di raggi γ, testata in cinque diversi dosaggi: 1.5, 5, 10, 15 e 25 kGy. L’efficacia di sterilizzazione è stata testata tramite il protocollo di analisi dell’efficacia di sterilizzazione sviluppato in questo progetto. Gli effetti della sterilizzazione sugli scaffold pericardici sono stati valutati tramite istologia, test biochimici e biomeccanici, microscopia elettronica a scansione (SEM) ed esperimenti di semina con cellule staminali mesenchimali umane da midollo osseo (hBM-MSC), allo scopo di valutarne la citotossicità e la proliferazione cellulare. I risultati del protocollo di sterilizzazione 1 hanno mostrato che il trattamento con AA + PAA è in grado di fornire tessuti sterili ad entrambe le concentrazioni testate. Le valutazioni istologica, biomeccanica e biochimica hanno dimostrato che il metodo AA + PAA, ad entrambe le concentrazioni di acido peracetico, non porta a sostanziali modifiche degli scaffold pericardici decellularizzati per quanto riguarda l’architettura delle fibre di collagene, il contenuto e la disposizione di proteine nella ECM. Tuttavia, PAA alla maggiore concentrazione è stato dimostrato indurre danni sul tessuto pericardico porcino ed, in particolare, la frammentazione della rete di collagene. Inoltre, la valutazione biomeccanica ha confermato la conservazione delle proprietà meccaniche degli scaffold bovini, al contrario dei tessuti di origine porcina in cui sono state osservate differenze dopo trattamento con PAA. Gli esperimenti di semina cellulare hanno rivelato la non citotossicità dei trattamenti su entrambi gli scaffold pericardici, confermata dalla mantenuta proliferazione cellulare osservata su tutti i tessuti nel tempo. Inoltre, la valutazione istologica dei campioni di pericardio sterilizzato e seminato ha mostrato la presenza di un monolayer cellulare uniforme sulla superficie tissutale dopo 14 giorni di coltura. Il Protocollo di Sterilizzazione 2, basato sul trattamento con raggi γ, si è dimostrato efficace nella eliminazione completa di tutti i contaminanti da pericardio sia porcino che bovino, anche a seguito dell’applicazione del dosaggio inferiore. Inoltre, l'indicatore biologico per questo trattamento (Bacillus pumilus), impiegato per simulare lo scenario peggiore, è stato rimosso dopo il trattamento con tutti i dosaggi testati. Infine, dopo analisi istologiche, biochimiche e SEM è stata osservata una ECM generalmente ben conservata. In sintesi, in questo progetto di dottorato è stato sviluppato un protocollo di valutazione dell’efficacia della sterilizzazione. Questo protocollo è stato progettato per verificare l’efficienza dei due diversi metodi di sterilizzazione di scaffold animali decellularizzati. Inoltre, i due protocolli di sterilizzazione (Protocollo di Sterilizzazione 1, comprendente AA + 0,05% PAA e Protocollo di Sterilizzazione 2, a dosaggio 1.5kGy) si sono dimostrati entrambi adeguati nella sterilizzazione dei tessuti senza alterare la struttura della ECM o la sua funzionalità. Le metodologie di sterilizzazione sviluppate sono state ottimizzate per i tessuti in studio, ma possono essere potenzialmente applicate su qualsiasi scaffold animale acellulare. Inoltre, questi metodi possono essere facilmente impiegati in laboratori di ricerca e in banche di tessuti, in quanto non richiedono attrezzature dispendiose e complesse da utilizzare.