In vitro and in vivo study of NETosis in diabetic wound healing

La FID, Federazione Internazionale del Diabete, paragona questa patologia ad una vera e propria epidemia inarrestabile. Una delle gravi complicanze causata da questa malattia sono le ulcere nel piede del diabetico (DFU, Diabetic Foot Ulcer): infatti la guarigione delle ferite è compromessa in molti pazienti diabetici e ciò provoca un aumentato rischio di morbilità e mortalità. I neutrofili sono le principali cellule coinvolte nelle prime fasi della guarigione delle ulcere, in quanto sono la principale componente cellulare reclutata in sede di danno tissutale. I neutrofili hanno un ruolo fondamentale nel sistema immunitario innato e rappresentano la prima difesa contro l’infezione da patogeni. Questa attività antimicrobica è resa possibile anche da un tipo di morte cellulare tipico dei neutrofili al quale è stato dato il nome di NETosi. La NETosi si differenzia da necrosi, apoptosi, necroptosi e autofagia. E’ innescata da PAD4 (Peptidil Arginine Deaminase 4) che è un enzima nucleare Ca2+-dipendente appartenente alla superfamiglia delle amidinotransferasi, coinvolto nella citrullinazione degli istoni. A questa fase seguono la decondensazione della cromatina, la migrazione dell’elastasi all’interno del nucleo e la rottura della membrana nucleare con il conseguente rilascio di DNA sottoforma di filamenti. Questi filamenti, chiamati NETs (Neutrophil Extracellular Traps), sono composti da enzimi e proteine granulari e da materiale nucleare, il cui compito è quello di intrappolare fisicamente i patogeni e le loro componenti, fino alla lisi cellulare. Questo processo è alterato nel diabete e può provocare danni ai tessuti, causando un ritardo nella guarigione delle ferite. Lo scopo di questo progetto è stato quello di studiare gli effetti della NETosi sulla guarigione delle ulcere dei pazienti diabetici, avvalendoci anche dell’uso di un modello sperimentale animale. L’analisi proteomica iniziale ci ha permesso di identificare le proteine coinvolte in questo processo; inoltre, abbiamo osservato che nel sangue dei pazienti diabetici vi è una sovra-espressione di alcuni di questi componenti. I neutrofili isolati da questi pazienti mostrano: 1- un incremento della NETosi spontanea; 2- un’alterata NETosi indotta; 3- un’aumentata attività dell’enzima PAD4. Per studiare meglio questo processo abbiamo messo a punto una tecnica di imaging intravitale nell’ulcera di modello murino, che parallelamente all’analisi citofluorimetrica degli istoni citrullinati, ha messo in risalto il coinvolgimento della NETosi nel processo di guarigione delle ulcere diabetiche. Inoltre l’inibizione di PAD4 nel topo, ha dato evidenze sperimentali di un miglioramento nella guarigione delle ulcere. In futuro questo protocollo sperimentale potrebbe essere utilizzato come strategia terapeutica di modulazione della NETosi per migliorare le DFU nei pazienti diabetici.