APPLICAZIONE SPERIMENTALE DI VASI UMANI DECELLULARIZZATI DI PICCOLO CALIBRO

Riassunto Ingegneria tissutale è il termine generico con cui si individua un vasto campo di studio e di applicazioni sperimentali ed industriali volti a ricreare in laboratorio tessuti biointegrabili nell’uomo allo scopo di sostituirne o riprodurne le funzioni in ambito di chirurgia rigenerativa. Una delle vie maggiormente utilizzate a tale fine è la realizzazione di un supporto ottenuto secondo diversi metodi e definito scaffold in grado di mimare perfettamente le caratteristiche sia strutturali che funzionali di tessuti od organi danneggiati, favorendo al contempo l’invasione cellulare e la sua integrazione nell’organismo ricevente. Nel campo dei tessuti vascolari, numerosi studi sono stati condotti al fine di produrre dei validi sostituti capaci in futuro di soppiantare l’utilizzo di bypass autologhi, non sempre disponibili e che comportano un danno secondario a volte non trascurabile. Ancora maggiore è l’esigenza nelle procedure microvascolari con vasi di piccole dimensioni. Negli anni, sono state ideati e realizzati condotti vascolari di materiale sintetico, riassorbibili o non riassorbibili, associati o meno a cellule staminali e fattori di crescita, scaffold ricavati da processi di decellularizzazione di vasi di piccolo calibro di origine animale e condotti vascolari realizzati con metodi scaffold free. Il presente studio ha prodotto dei modelli sperimentali animali in cui tratti di vasi femorali di coniglio sono stati sostituiti, in vivo, con scaffold ricavati da un processo di decellularizzazione di vasi umani di piccolo calibro (diametro interno < 6mm). Materiali e metodi Sono state prelevate due arterie e due vene umane di piccolo calibro (DI < 6 mm) ottenute da tessuti umani vivi di arto superiore ,previo consenso informato, ove non era possibile procedere a loro reimpianto e sottoposte ad un processo di decellularizzazione secondo un adattamento del protocollo di Sheridan. L’efficacia del processo è stata dimostrata, in vitro, con analisi istologiche, immunoistochimiche, ultrastrutturali, e analisi qualitative e quantitative del DNA. Abbiamo altresì condotto analisi meccaniche e valutazioni ecocolorDoppler in vivo della funzionalità. I vasi decellularizzati sono stati impiantati, in vasi femorali di conigli adulti realizzando un anastomosi termino-terminale. a pervietà è stata verificata, in vivo, al tempo 0, dopo 10 e dopo 20 minuti. Le cavie sono state sacrificate a 30 giorni ( impianti venosi) e 10 e 40 giorni (impianti arteriosi) , è stata verificata la pervietà degli innesti prelevati e sono state eseguite analisi istologiche e immunofenotipiche per rilevare il processo infiammatorio e di ricellularizzazione. Un controllo è stato rappresentato dall'impianto di sostituti vascolari sintetici pro arteria con sacrificio a 2 settimane. Risultati Le varie analisi in vitro dei vasi decellularizzati hanno dimostrato la totale riuscita del processo. La componente cellulare è stata eliminata senza alterare la composizione e la struttura tridimensionale della matrice extra cellulare, come dimostrato anche da test meccanici. Gli scaffold sono stati impiantati con successo e in tutti i modelli la pervietà è stata mantenuta fino al sacrificio degli animali. L’analisi Doppler ha ulteriormente confermato la sovrapponibilità con i tessuti originali ed il mantenimento del flusso senza evidenza di trombosi. Le analisi istologiche e immunofenotipiche degli scaffold prelevati hanno evidenziato un minimo processo infiammatorio, il mantenimento della struttura della matrice extracellulare e la ricellularizzazione sia della parete che della superficie luminale vascolare. Gli impianti sintetici hanno dimostrato invece una completa trombizzazione. Conclusioni Gli adattamenti apportati al protocollo di decellularizzazione proposto da Sheridan su animale si sono dimostrati parimenti efficaci sul tessuto umano, procedendo , anzi, ad una migliore qualità nella decellularizzazione che ha favorito l’integrazione in vivo. Grazie al mancato utilizzo di cellule staminali endoteliali i costi del processo risultano estremamente ridotti, seppure l’efficacia sia dimostrata per brevi tratti e ,per favorire l’integrazione di vasi di maggiore lunghezza ( come nei peduncoli micorvascolari dei lembi) il ricorso al potenziamento cellulare rimane una strada necessaria. Le analisi istologiche sui prelievi degli innesti hanno dimostrato una minima presenza di processi infiammatori, una completa pervietà sino a 6 settimane con un processo di neoendotelizzazione arteriosa.