From milk to cheese: genomic background, biological pathways and latent phenotypes of bovine cheese-related traits

Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato lo studio del background genomico, biologico e fenotipico di caratteri legati al processo di caseificazione nella specie bovina. L’obiettivo primario è stato quello di determinare il background genomico di caratteri tecnologici del latte bovino legati al processo di caseificazione (CAPITOLI da 1 a 3). Per raggiungere questo obiettivo, l’abilità della bovina di produrre formaggio è stata ripartita in 26 fenotipi: 11 caratteri di attitudine casearia e proprietà di coagulazione, comprendenti le tradizionali proprietà di coagulazione del latte (MCP) e nuovi parametri modellizzati di consistenza della cagliata (CFt), e 7 fenotipi di resa in formaggio (CY) e recupero dei nutrienti del latte nella cagliata (REC). Tuttavia, l'elevato numero di variabili necessarie per descrivere la produzione di formaggio bovino pone delle restrizioni nella costruzione di indici di selezione, e quindi nel prendere decisioni di selezione. Per superare il problema della elevata dimensionalità, è stata utilizzata un’analisi fattoriale (FA) per studiare la struttura latente dei 26 caratteri coinvolti nel processo di caseificazione (CAPITOLI 4 e 5). I caratteri MCP includevano le 3 proprietà lattodinamografiche tradizionali basate su singola misurazione dello strumento (RCT: tempo di coagulazione, in min; k20: tempo di rassodamento, in min; a30: consistenza del coagulo (CF) 30 min dopo l'aggiunta del caglio, in mm). I fenotipi CFt comprendevano un set di 6 parametri modellizzati sulla base di 360 dati di CF misurati per ciascun campione di latte (CFp: CF potenziale, in mm; kCF: tasso di rassodamento del coagulo, in % × min-1; kSR: tasso di sineresi, in % × min-1; RCTeq: RCT stimato dal modello; CFmax: massima CF, in mm; tmax: tempo necessario per raggiungere CFmax, in min), delle proteine del latte (%) e del pH. I 3 caratteri CY includevano resa a fresco (% CYCURD), resa in solidi (% CYSOLIDS), e acqua ritenuta nella cagliata (% CYWATER), espresse come percentuale del latte trasformato. Le 4 misure di REC (RECFAT, RECPROTEIN, RECSOLIDS, e RECENERGY) sono state calcolate come rapporto espresso in percentuale tra il valore di nutrienti nella cagliata e il corrispettivo nel latte. L’analisi FA ha considerato tutti i 26 caratteri oggetti di studio, comprendenti produzione e qualità del latte (incluse le frazioni proteiche del latte), parametri CFt e caratteri CY-REC. La metodologia adottata comprendeva analisi di associazione genome-wide (GWAS), accompagnata da analisi di arricchimento genetico e di tipo pathway-based. Le analisi genomiche hanno considerato un totale, 1.152 bovine di razza Bruna Italiana allevate in 85 allevamenti, genotipizzate attraverso il v.2 Illumina SNP50 Beadchip. Le analisi GWAS sono state condotte mediante analisi di regressione a singolo marcatore, fittate utilizzando il pacchetto GenABEL del software R (GRAMMAR-GC). I database Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono stati interrogati per le analisi di arricchimento. Nell’analisi GWAS (CAPITOLI 1 e 2) sono stati individuati picchi nitidi sull’autosoma 6 di Bos taurus (BTA) tra 84-88 Mbp, con il picco più alto rilevato a 87,4 Mbp nella regione ospitante i geni della caseina e più precisamente della κ-CN (CSN3). Il marcatore Hapmap52348-rs29024684 (~ 87,4 Mbp), localizzato in prossimità dei geni della caseina su BTA6, ha mostrato una forte associazione con RECFAT (P = 1.91 × 10-15) e CFP (P = 1.62 × 10-17). Sullo stesso cromosoma, è stata trovata evidenza di loci per i caratteri quantitativi a 82,6 e 88,4 Mbp. Su BTA11, il marcatore ARS-BFGL-NGS-104.610 (~ 104,3 Mbp) è risultato fortemente associato con RECPROTEIN (P = 6,07 × 10-36). Oltre a BTA6 e 11, altri SNP situati in altri 15 cromosomi (1, 2, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 26, 27 e 28) sono risultati significativamente associati con MCP, CFt e con i caratteri CY-REC. L'analisi di arricchimento e pathway-based (CAPITOLO 3) ha rivelato 21 categorie GO e 17 categorie KEGG significativamente associate (tasso di errore controllato al 5%) con 7 tra i caratteri fenotipici considerati (RCT, RCTeq, kCF, %CYSOLIDS, RECFAT, RECSOLIDS e RECENERGY) e alcune categorie sono risultate in comune tra i caratteri. Le categorie significativamente arricchite includevano vie di segnalazione del calcio, di secrezione salivare, vie metaboliche, di digestione e assorbimento dei carboidrati, di giunzioni occludenti e del fosfatidilinositolo, così come vie legate allo stato di salute della ghiandola mammaria bovina, per un totale di 150 geni situati in tutti i cromosomi tranne 9, 20 e 27. Nella FA (CAPITOLI 4 e 5) sono stati ottenuti dieci Fs mutualmente ortogonali utilizzando una rotazione varimax. I 10 Fs spiegavano il 74% della variabilità originale. Tali Fs erano biologicamente riconducibili a elementi base del processo di trasformazione “dal latte al formaggio". Più precisamente, i primi 4 Fs, ordinati sulla base della varianza spiegata, sono stati in grado di definire la struttura latente della CY percentuale (F1% CY), del processo di CF nel tempo (F2CFt), del rendimento di latte e solidi (F3Yield) e della presenza di azoto (N) nel formaggio (F4Cheese N). Inoltre, 4 Fs (F5αs1-β-CN, F7β-κ-CN, F8αs2-CN, F9αs1-CN-P) erano associati alle caseine del latte (as1-CN, as2-CN, β-CN, κ-CN, e la forma fosforilata as1-CN) e 1 fattore alla proteina del siero α-LA (F10α-LA). É stato inoltre ottenuto un fattore in grado di descrivere lo stato di salute della mammella bovina (F6Udder health), basato principalmente sulla produzione di lattosio e di altri composti azotati e sulle cellule somatiche. In generale, i risultati nell’analisi FA sono risultati coerenti con l’attribuzione del significato biologico dato al fattore. La maggior parte degli Fs è risultata significativamente influenzata dallo stadio di lattazione, seguito dall’ordine di parto. Sono state inoltre riscontrate correlazioni genetiche rilevanti tra i fattori (CAPITOLO 4). Nell’analisi GWAS tutti gli Fs hanno mostrato associazioni significative (P <5 × 10-5), ad eccezione di F5Yield. I picchi elevati su BTA6 (~ 87Mbp) e sulla coda di BTA11 (~ 104Mbp) erano principalmente associati a F6β-κ-CN e F1Cheese N, rispettivamente. Inoltre, 33 termini GO e 6 categorie KEGG sono risultati arricchiti e associati con F1% CY, F4Cheese N, F8αs2-CN e F10α-LA. Le vie di segnalazione biologica descritte dai fattori erano principalmente correlate alle categorie più generali di attività ionica, neuroni e giunzioni occludenti. Poichè un numero considerevole di categorie arricchite GO e KEGG è risultato associato al fattore F8αs2-CN, maggiore attenzione dovrebbe essere posta sulla frazioneαs2-CN (CAPITOLO 5).