Development and validation of a high-throughput system for the genotyping of Hepatitis C Virus

In questa tesi di dottorato viene esposto il lavoro che ho svolto presso l'Università degli Studi di Padova in collaborazione con il CRS (Centro Ricerche Scientifiche) Dott. Dino Paladin. The CRS Dott. Dino Paladin è un centro specializzato nella ricerca biotecnologica e che collabora con l'azienda AB ANALITICA per lo sviluppo e commercializzazione di kit diagnostici marcati CE IVD. Per il mio progetto di dottorato mi sono focalizzata nello sviluppo di una procedura standardizzata e performante per la genotipizzazione del Virus dell''Epatite C (HCV). HCV è un piccolo virus a singolo filamento positivo di RNA, dotato di envelope e appartanente alla famiglia dei Flaviviridae. Esso è l'agente eziologico delle cosi chiamate epatiti post-trasfusionali non-A non-B. L'organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) ha stimato 130-150 milioni di persone al mondo manifestanti infezioni croniche di HCV, e la morbilità e la mortalità attribuibile a tale virus sono in continuo aumento. Nonostante la ricerca miri alla formulazione di una terapia antivirale pangenotipica, ad oggi il genotipo di HCV è ancora richiesto al fine di selezionare la miglior terapia antivirale per il paziente infetto. Data la numerosità richiesta di tali analisi, abbiamo deciso di disegnare e sviluppare un processo high-throughput per la genotipizzazione di HCV, che compra le procedure da eseguire a partire dal campione clinico fino al risultato in termini di genotipo. Nella prima parte del mio dottorato, mi sono occupata dello sviluppo di un processo automatico per l'estrazione di acidi nucleici virali. In particolare, abbiamo sviluppato il kit GENEQUALITY X120 Pathogen da utilizzare con la piattaforma automatica GENEQUALITY X120 (AB ANALITICA srl). Questo kit ha mostrato efficienza di estrazione per sia DNA che RNA virale e perciò viene scelto per essere utilizzato per l'estrazione del RNA di HCV. Nella seconda parte del mio dottorato mi sono focalizzata sulla validazione di un kit precedentemente sviluppato, AMPLQUALITY HCV TYPE PLUS, per la genotipizzazione di HCV, a partire dagli estratti di RNA ottenuti con la piattaforma sviluppata. I risultati mostrano l'efficienza del kit nella genotipizzazione e sottotipizzazione di HCV. I kit sviluppati sono attualmente marcati CE IVD e commercializzati.