A novel model of Miller Fisher syndrome to study motor axon terminal regeneration

La giunzione neuromuscolare (neuromuscular junction, NMJ) è una sinapsi ‘tripartita’, composta da un terminale assonico di un motoneurone (motor axon terminal, MAT), una fibra muscolare postsinaptica, e da cellule di Schwann perisinaptiche (perisynaptic Schwann cells, PSC). La funzionalità della NMJ è essenziale per l’esecuzione dei movimenti corporei. Tuttavia la sua anatomia la rende particolarmente esposta ad una vasta gamma di stimoli patologici, quali neurotossine animali e batteriche, sostanze tossiche, traumi meccanici e malattie autoimmuni. Nella sindrome di Miller Fisher (Miller Fisher Syndrome, MFS), auto-anticorpi riconoscono specifici gangliosidi (>90% GQ1b) presenti nel MAT e attivano la cascata del complemento alla sua superficie, causandone la degenerazione. Questo danno è reversibile, in quanto il MAT è in grado di rigenerare completamente e di ristabilire la trasmissione sinaptica. Le PSC sono tra i principali effettori della rigenerazione della NMJ. Ad oggi, tuttavia, l’attuale comprensione dei ruoli di queste cellule in questa neuropatia autoimmune è principalmente fenomenologica, e ulteriori studi molecolari. È stato riportato che il MAT in degenerazione rilascia segnali di allarme (alarmine) capaci di attivare il fenotipo di pro-rigenerazione delle PSC. Dunque si può dedurre che il MAT gioca un ruolo attivo nel processo della propria degenerazione. Inoltre è probabile che molti altri segnali siano generati da parte di tutti e tre i componenti della NMJ, che generano così un network complesso di comunicazione intercellulare, il quale è stato solo parzialmente compreso. Nel progetto di dottorato qui presentato è stato sviluppato un nuovo modello in vivo di MFS, allo scopo di chiarire gli eventi molecolari e cellulari che avvengono nelle PSC in seguito a danno del MAT osservato nella MFS. Ciò è stato permesso tramite l’utilizzo di FS3, un anticorpo monoclonale che riconosce gangliosidi associati alla MFS, e siero umano (normal human serum, NHS), utilizzato come fonte di proteine del complemento. La amministrazione subcutanea nel muscolo LAL, o intramuscolare nel muscolo soleo, della combinazione di questi due elementi induce la degenerazione del MAT, e i suoi frammenti vengono fagocitati e degradati dalle PSC. Entro pochi giorni dall’iniezione la rigenerazione del MAT è completa sia a livello morfologico che funzionale, come evidenziato da analisi di immunofluorescenza ed elettrofisiologiche. Gli effetti osservati sono strettamente dipendenti dall’anticorpo e dal sistema del complemento, in quanto non viene osservata neurodegenerazione in assenza di FS3 o quando il NHS viene inattivato al calore. Allo scopo di identificare le alarmine neuronali responsabili dell’attivazione delle PSC e le conseguenti risposte molecolari di quest’ultime, è stato parallelamente sviluppato un modello in vitro di MFS, che consiste nell’esposizioneì della combinazione di FS3 e NHS (FS3+NHS) a colture primarie di neuroni cerebellari o di motoneuroni da midollo spinale. Ciò causa un’entrata massiccia e incontrollata di calcio (Ca2+) a livello dei neuriti, associata alla formazione di protuberanze, o bulges, a livello dei neuriti stessi. Questi bulges sono siti di accumulo di mitocondri gonfi e disfunzionali, e di produzione di perossido di idrogeno (H2O2). Il perossido di idrogeno è un segnale di allarme per le cellule di Schwann (Schwann cells, SC). Infatti in co-colture di neuroni e SC, il H2O2 derivante dai neuroni attaccati da FS3+NHS induce l’attivazione nelle SC del pathway di ERK1/2, conosciuto per il suo importante ruolo di induzione del fenotipo pro-rigenerazione delle SC. Inoltre, tramite il modello in vitro di MFS, è stata identificata una seconda alarmina coinvolta nell’attivazione delle SC, l’adenosina trifosfato (ATP). Infatti, neuroni primari esposti al complesso FS3+NHS rilasciano nel mezzo extracellulare ATP, che a sua volta induce oscillazioni intracellulari di Ca2+ nelle SC. Queste oscillazioni sono abolite in presenza di apirasi, un enzima che degrada l’ATP, nel mezzo di incubazione. In aggiunta, esperimenti con un sensore FRET per l’AMP ciclico (cAMP) hanno mostrato che i livelli di SC aumentano in co-colture di neuroni e SC in seguito al danno neuronale esercitato da FS3+NHS. All’aumento di cAMP intracellulare osservata ne consegue un’aumentata fosforilazione (ovvero attivazione) del fattore di trascrizione CREB (cAMP response element-binding protein), anch’essa ATP-dipendente. In conclusione, il lavoro svolto in questo progetto di dottorato ha portato allo sviluppo di nuovo modelli in vivo e in vitro di MFS. Questi sono stati utilizzati per lo studio della comunicazione molecolare tra il MAT e le PSC. Il perossido di idrogeno e l’ATP sono stati identificati come importanti alarmine neuronali, capaci di attivare il fenotipo pro-rigenerazione delle SC. Crediamo che questi risultati contribuiscano a gettare luce sugli eventi molecolari e cellulari che avvengono alla NMJ nella MFS, e che queste conoscenze possano venire estese anche ad altre patologie che affliggono il MAT.