Validazione di un percorso diagnostico rapido per l'analisi del fenotipo di sensibilità dei batteri Gram negativi

Il problema delle infezioni da germi multiresistenti è complesso e di gravità sempre crescente, a causa dell’incremento della loro diffusione e del mancato sviluppo di nuove opzioni terapeutiche. Un’efficace soluzione è rappresentata dai programmi di antimicrobial stewardship, che prevedono una stretta collaborazione interdisciplinare allo scopo di ottimizzare la terapia antimicrobica, contenere le epidemie da germi multiresistenti e creare iter diagnostici mirati, specie nel caso delle infezioni invasive. L’attività di ricerca svolta ha avuto lo scopo di validare un percorso diagnostico innovativo per l’analisi rapida del fenotipo di sensibilità dei batteri Gram negativi. Ad oggi, infatti, nella diagnosi microbiologica di sepsi, l’antibiogramma secondo brodo-diluizione rappresenta ancora il gold-standard; tuttavia sussiste la necessità di fornire il risultato in tempi sempre più brevi, per consentire al clinico di perfezionare la terapia iniziata empiricamente. Per questo motivo, il limite dato dalle lunghe tempistiche attuali è sempre più gravoso, seppur le tecnologie attuali consentano di integrare nella routine di laboratorio metodi veloci ed efficaci, come le analisi in biologia molecolare. Vari autori hanno indagato nuovi percorsi di identificazione rapida del fenotipo di sensibilità, ma ad oggi non è ancora presente nessuno studio conclusivo e nessuna indicazione ufficialmente validata e riconosciuta per l’uso delle metodiche rapide di rilevazione delle resistenze nella real-life, lasciando alla responsabilità e all’esperienza del medico microbiologo l’adozione di protocolli operativi e la loro integrazione nel work-flow del laboratorio. Nel primo studio, pertanto, è stata validata una procedura innovativa di esecuzione dell’antibiogramma, in grado di anticiparne il risultato di circa 24 ore, grazie all’analisi dopo semina a spot, che permette di ottenere la rapida crescita di una patina batterica. Sono stati inclusi in questa analisi 145 ceppi di E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa, con differenti profili di sensibilità, che sono stati analizzati sia secondo il metodo di riferimento che secondo il metodo rapido per la determinazione della MIC. Nel complesso, i dati ottenuti hanno evidenziato una performance soddisfacente, per quanto riguarda la ripetibilità, la concordanza tra le due metodiche, la sensibilità e la specificità. Anche gli errori rilevati, analizzando i singoli antibiotici e il totale delle MIC complessivamente determinate, sono risultati entro il limite di accettabilità del metodo; tuttavia, sono state osservate alcune criticità, soprattutto riguardo all’attendibilità dei risultati per Ampicillina/Sulbactam, Piperacillina/Tazobactam e Fosfomicina, che potrebbero essere escluse dalla refertazione dell’antibiogramma “rapido” senza precluderne l’utilità per l’aggiustamento della prima linea terapeutica. Il secondo studio, invece, ha valutato l’applicazione della spettrometria di massa alla rilevazione rapida della resistenza ai fluorchinoloni, con particolare attenzione all’espressione della variante della aminoacetiltrasferasi AAC(6’)-Ib-cr. A tale scopo, sono stati inclusi nella ricerca 72 ceppi di Escherichia coli, seminati a spot su piastre di agar sangue, incubati per 5 ore con disco di norfloxacina ed infine raccolti per l’analisi dello spettro proteico tramite MALDI-TOF. Per lo studio è stato utilizzato il software Saramis™ dello strumento Vitek-MS® (BioMerieux), che ha consentito l’analisi scorporata dei singoli spettri rilevati. In particolare, sono stati ricercati gli spettri corrispondenti alle forme di norfloxacina native e acetilate (metodo “indiretto”) e il picco corrispondente all’enzima aac(6’)-Ib-cr (metodo “diretto”). In entrambi i casi, la valutazione non ha dato risultati soddisfacenti, sia in termini di concordanza con il metodo tradizionale, che di specificità e sensibilità. In conclusione, il percorso diagnostico rapido per la determinazione della MIC è risultato valido in termini di riproducibilità e affidabilità e può essere applicato, seppur con alcune riserve, nella diagnosi microbiologica di sepsi. Al contrario, la rilevazione della resistenza ai chinoloni tramite spettrometria di massa con il metodo indagato non ha dimostrato alcuna applicabilità nella pratica clinica. Ulteriori approfondimenti potranno essere presi in considerazione, tenendo sempre conto della necessità di garantire un risultato rapido e preciso, che non tralasci la centralità di una diagnosi e cura sempre guidate da expertise, prudenza e monitoraggio clinico.