Role of miR-182 in neoplastic progression of colorectal cancer

Numerosi studi hanno dimostrato che l’alterata espressione di specifici microRNA (miRNAs) è coinvolta in molti tipi di tumore, incluso il cancro del colon-retto (CRC). In particolare, in un precedente studio abbiamo integrato dati di espressione di miRNA e geni ottenuti da chip array, confrontando tessuto colico normale, tumore primario e metastasi epatiche, e abbiamo concentrato la nostra attenzione sulle reti regolatorie post-trascrizionali con miRNA differenzialmente espressi e le loro relazioni supportate con i geni bersaglio. Abbiamo dimostrato che il miR-182 risultava essere uno dei più up-regolati nel CRC primario rispetto alla mucosa normale di colon. Partendo da questi persupposti, gli obiettivi del progetto sono stati i seguenti: 1) Identificazione di miRNAs come possibili biomarcatori per il monitoraggio e lo screening nei pazienti con tumore del colon; 2) Analisi degli effetti funzionali indotti dall'inibizione del miR-182 in linee cellulari di tumore del colon caratterizzate da un diverso comportamento tumorigenico in vivo. Per quanto riguarda il primo obiettivo, abbiamo pubblicato un lavoro (68, appendice 1) in cui si conferma il coinvolgimento del miR-182 nello sviluppo e nella progressione del CRC. In particolare, in questo studio sono stati inclusi complessivamente 240 campioni istopatologici e 51 plasmatici. Abbiamo osservato una significativa sovra-espressione di miR-182 nel tumore primario rispetto alla mucosa normale di colon, la quale si mantiene anche nelle metastasi epatiche. Abbiamo anche dimostrato che i livelli plasmatici di miR-182 sono significativamente più elevati nei pazienti con CRC rispetto ai controlli sani. Inoltre, i livelli di miR-182 nel plasma si riducono significativamente dopo la metastasectomia radicale epatica. Questi risultati suggeriscono che la valutazione dei livelli di miR-182 circolante potrebbero essere un approccio promettente per ampliare la disponibilità di biomarcatori non invasivi per il monitoraggio e lo screening di questi pazienti. Per rafforzare queste evidenze, abbiamo effettuato uno studio prospettico su una casistica indipendente di CRC allo stadio I-II (N0 M0) e abbiamo pre-selezionato alcuni miRNA fortemente regolati: il miR-139 e 4 coinvolti nella stessa rete post-trascrizionale (miR-18a, miR-21, miR-182 e miR-183). Questi 5 miRNA sono significativamente modulati nel tessuto tumorale rispetto alla mucosa normale di colon. Inoltre, abbiamo osservato che miR-182, miR-183 e miR-139 non risultano modulati nel tessuto infiammatorio rispetto alla mucosa normale; per contro, il miR-18a e il miR-21 sono significativamente regolati anche nel processo legato all'infiammazione. Per valutare il possibile ruolo predittivo di questi miRNA i pazienti sono stati suddivisi in gruppi ricorrenti e non ricorrenti entro 55 mesi. Abbiamo quindi calcolato 10 ratio tra i valori di espressione di tutte le possibili coppie di miRNA, sia nel tessuto tumorale che nella mucosa normale adiacente. Nessuno dei miRNA ratio è risultato predittivo quando valutato nel tessuto tumorale; tre miRNA ratio valutati nella mucosa adiacente al tumore risultano, invece, predittori significativi della ricaduta a 55 mesi dalla resezione: miR-21/miR-183, miR-18a/miR-182 e miR-18a/miR-183. Manuscript submitted. Per quanto riguarda il secondo obiettivo, per approfondire il ruolo funzionale svolto dal miR-182 nella tumorigenesi abbiamo valutato gli effetti indotti dalla sua inibizione. A questo scopo, abbiamo utilizzato due linee di CRC come modello in vitro: MICOL-14h-tert (una linea cellulare non tumorigenica in vivo derivata da metastasi linfonodali del cancro rettale), e la sua variante tumorigenica in vivo MICOL-14tum ( o TC22). Abbiamo effettuato esperimenti di trasfezione per l'inibizione transitoria del miR-182 e abbiamo osservato un significativo aumento dell'apoptosi in entrambe le linee cellulari dopo il trattamento. Abbiamo confermato i risultati mediante l’identificazione di PARP e Caspasi-3 in Western Blot. Inoltre abbiamo valutato l'effetto dell'inibizione di miR-182 sulla crescita tumorale in vivo. A tal fine abbiamo eseguito inoculi sottocute di cellule TC22 trattate con anti-miR-182 in topi NOD/SCID, e dopo una settimana abbiamo eseguito un'ulteriore iniezione intra-tumorale in vivo di anti-miR-182 per mantenere il silenziamento. È interessante notare che l'inibizione del miR-182 riduce significativamente la dimensione del tumore, il quale presenta caratteri di minore aggressività rispetto ai controlli. Manuscript in preparation. In conclusione: - i livelli di espressione del miR-182 possono essere rilevati nel tessuto e nel plasma dei pazienti affetti da CRC. In particolare, la valutazione del miR-182 circolante potrebbe essere un approccio promettente per migliorare il repertorio di biomarcatori non invasivi per il monitoraggio e lo screening; - il gruppo di miRNA selezionati è risultato significativamente regolato anche nelle fasi iniziali del processo tumorale, estendendo alla fase I-II i risultati già ottenuti nei CRC fase IV; - non un singolo miRNA, ma piuttosto un'alterazione coordinata di quattro miRNA può essere utile per prevedere la ricorrenza dopo la resezione nel CRC precoce quando valutata nella mucosa normale adiacente al tumore; - nelle linee cellulari di CRC il livello di espressione del miR-182 è più elevato nella variante tumorigenica in vivo, suggerendo un suo ruolo nell’aggressività tumorale. In particolare sembra essere coinvolto nel sostenere la sopravvivenza delle cellule tumorali e la crescita del tumore stesso.