Aspetti clinici, epidemiologici e genetici delle diverse forme di trombocitopenie ereditarie

Le piastrinopenie congenite sono un eterogeneo gruppo di patologie caratterizzato da ridotto numero di piastrine e si presentano con manifestazioni cliniche variabili da forme gravi a forme più lievi di riscontro casuale. Si suddividono in piastrinopenie da difetto della differenziazione e maturazione megacariocitaria, difetto di migrazione dei MK dalla nicchia ossea del midollo a quella vascolare e della elongazione delle pro-piastrine. Vi sono poi le piastrinopenie ereditarie da ridotta sopravvivenza piastrinica e le piastrinopenie a patogenesi ancora sconosciuta. Attualmente si conoscono almeno 20 geni i cui difetti genetici determinano un fenotipo caratterizzato da trombocitopenia ereditaria, ma circa il 50% dei pazienti hanno forme che non coincidono con nessun difetto noto. Negli ultimi anni sono emerse alcune forme di piastrinopenia ereditaria associate allo sviluppo di neoplasie di tipo ematologico e non ematologico che hanno destato un estremo interesse nei ricercatori; in particolare le forme associate a mutazioni di ANKRD26, RUNX1 e ETV6. Scopo Lo scopo di questo lavoro è quello di: 1. Costruire un database completo dei pazienti con piastrinopenia familiare finora pervenuti nel nostro laboratorio, definendo le mutazioni genetiche rinvenute. 2. Condurre uno studio preliminare sulla presenza di mutazioni in 5’UTR di ANKRD26 in pazienti con piastrinopenia sporadica e familiare, che non rientravano in forme note di piastrinopenia ereditaria e che presentavano volume piastrinico nella norma (4μm˂MPV˂8μm), definendone le caratteristiche cliniche e molecolari di questa nuova forma di piastrinopenia ereditaria e studiando le famiglie con mutazioni in questo gene. 3. Ampliare l’indagine ad altri due geni coinvolti in forme di piastrinopenia ereditaria con predisposizione a neoplasie ematologiche: RUNX1 ed ETV6. 4. Raccogliere e analizzare i dati relativi al corso della gravidanza in una ampia coorte di pazienti con forme di IT (inherited thrombocytopenia). Materiali e metodi Presso l’Unità di Clinica Medica 1 dell’Azienda Ospedale-Università di Padova è presente una casistica di circa 70 pedigree familiari di soggetti con piastrinopenia familiare da difetto ignoto. La valutazione comprende storia clinica e lo studio dell’espressione degli antigeni piastrinici di superficie mediante metodica citofluorimetrica utilizzando anticorpi monoclonali. Per valutare la morfologia piastrina è stato adottato il metodo della colorazione con May-Grunwald/Giemsa (MGG) su strisci di sangue periferico (macro, micro e normo trombocitopenia). Il DNA è stato estratto da sangue intero e amplificato per lo studio dei seguenti geni: GpIbα, GpIbβ, GpIX, MYH9, ACTN1. I prodotti delle reazioni di amplificazione sono stati visualizzati con elettroforesi su gel di agarosio marcato e quindi sequenziati con metodo di Sanger. Abbiamo condotto uno studio preliminare sulla presenza di mutazioni in 5’UTR di ANKRD26 in pazienti con piastrinopenia sporadica e familiare, che non rientravano in forme note di piastrinopenia ereditaria e che presentavano volume piastrinico nella norma (4μm˂MPV˂8μm) per poterne definire le caratteristiche cliniche e molecolari. Abbiamo quindi ampliato l’indagine a RUNX1 ed ETV6, due geni coinvolti in forme di piastrinopenia ereditaria con predisposizione a neoplasie ematologiche in pazienti piastrinopenici e non (MDS piastrinopenia +; MDS piastrinopenia -) appartenenti alle diverse classi di sindrome mielodisplastica sec. WHO 2008. Infine, nell’ambito delle piastrinopenie familiari confermate mediante indagine genetica, abbiamo partecipato al Pregnancy In Inherited Platelet Abnormalities (PIPA), studio multicentrico retrospettivo di valutazione di 339 gravidanze in 181 donne con 13 diverse forme di trombocitopenia. Risultati 8 famiglie (12%) presentano mutazioni nella MYH9, MYH9-related disease, 12 famiglie (19%) presentano mutazioni del gene GP1Bα, 4 famiglie (6%) presentano mutazioni del gene GP1Bβ che causano Bernard-Soulier Syndrome (BSS) mono o biallelico. Le rimanenti famiglie (60%) non presentano mutazioni genetiche sulle glicoproteine studiate, e nessuna mutazione sul gene ACTN1. Alla luce dei recenti studi relativi alle forme di piastrinopenie ereditarie caratterizzate, nel nostro laboratorio abbiamo condotto uno studio preliminare sulla presenza di mutazioni in 5’UTR di ANKRD26 in pazienti con piastrinopenia sporadica e familiare, che non rientravano in forme note di piastrinopenia ereditaria e che presentavano volume piastrinico nella norma (4μm˂MPV˂8μm), identificando due diverse mutazioni in eterozigosi, localizzate nella regione del 5’UTR non tradotta del gene. Dato l’interesse nello studio delle piastrinopenie ereditarie associate allo sviluppo di neoplasie di tipo ematologico e non ematologico, in particolare dei geni RUNX1 ed ETV6, responsabili di trombocitopenia non sindromica a trasmissione autosomica dominante, abbiamo preliminarmente raccolto una piccola casistica di soggetti mielodisplastici piastrinopenici (9 soggetti), di soggetti mielodisplastici con conta piastrinica nei limiti di norma (12 soggetti) e di 27 soggetti di controllo con trombocitopenia ereditaria indeterminata; questo per rinforzare le evidenze circa una possibile associazione tra mutazioni dei geni citati, piastrinopenia e rischio di evoluzione mielodisplastica/leucemica. Di questi soggetti abbiamo raccolto i dati relativi all’età, sesso, cariotipo, numero di blasti, emoglobina e piastrine. I dati preliminari (Tabella 1) dimostrano che le mutazioni dei geni RUNX1 e ETV6 sono presenti solo nel gruppo dei mielodisplastici piastrinopenici. GENE POSIZIONE MUTAZIONE RUNX-1 ESONE 4 c.76C>G RUNX-1 ESONE 8 c.934del A RUNX-1 ESONE 9 c.1214_1215insTG ETV6 INTRONE 1 c.28+192delC Tabella 1. Mutazioni rinvenute nei geni RUNX1 ed ETV6 Anche se il coinvolgimento di questi geni nella piastrinopoiesi è noto, l’esatto meccanismo responsabile di trombocitopenia non è ancora chiaro. La rarità di queste patologie rende difficile raccogliere dati utili ad una analisi genotipo-fenotipo. Nello studio multicentrico (PIPA) abbiamo classificato 23 gravidanze (13 donne): 5 donne presentano bBSS, 3 mBSS, 4 MYH9-RD, 1 ANKRD26. L’età media alla diagnosi di trombocitopenia è di 30 anni, la conta media piastrinica prima del parto è di circa 60 x 109 piastrine/L, anche se in alcuni casi è stata osservata una drastica riduzione piastrinica. La tendenza al sanguinamento è bassa prima del parto e solo in due gravidanze è stata necessaria la trasfusione di piastrine. Tutte le nascite sono avvenute tra la 34a e 40 a settimana; 13 sono i nati con parto cesareo e 10 con parto naturale. Solo 9 neonati riportano la stessa patologia della mamma, anche se in 6 casi il dato non è disponibile poiché non sono state fatte indagini a riguardo. Abbiamo riscontrato un unico caso di decesso neonatale a causa di emorragia cerebrale, ma nessun caso di sanguinamento nei nuovi nati. Conclusioni Le piastrinopenie rappresentano il più frequente disordine dell’emostasi e costituiscono un gruppo eterogeneo di entità cliniche. La peculiarità delle forme familiari risiede nella difficoltà della loro identificazione clinica poiché spesso le piastrinopenie vengono classificate come immuni ed i pazienti sottoposti a terapie inappropriate. Come riportato nei risultati di studi recenti che coinvolgono un numero di famiglie più elevato, anche nel nostro lavoro le forme più comuni di piastrinopenia familiare risultano essere la BSS, la MYH9-RD seguite dalla ANKRD26. Grazie ad una attenta analisi clinica ed alle indagini genetiche associate a recenti studi molecolari, ad oggi è possibile individuare e classificare correttamente i pazienti con nuove mutazioni genetiche considerando che ancora più del 50% delle famiglie non ha diagnosi. Per valutare possibili meccanismi implicati nello sviluppo di piastrinopenia in corso di sindromi mielodisplastiche sarà indispensabile studiare in modo estensivo queste tre categorie di pazienti: piastrinopenie ereditarie con difetto noto di ANKRD26, RUNX-1 e ETV6, mielodisplasie o leucemie con prevalente piastrinopenia. Aumentare la casistica di tali soggetti ci permetterà di approfondire lo studio funzionale delle mutazioni definendone le caratteristiche cliniche e molecolari, al fine di valutare un possibile link tra mielodiplasia e piastrinopenia e comprendere a che livello della megacariopoiesi e dell’ematopoiesi esse agiscano