Studio dell'attività antiossidante di metaboliti secondari da piante medicinali nella prevenzione del danno vascolare

Le specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto rivestono un ruolo importante nella patogenesi di numerose malattie, tra le quali la neurodegenerazione, l’infiammazione cronica, il cancro e le malattie cardiovascolari come l’aterosclerosi, le cardiopatie ischemiche e l’ipertensione. Studi sperimentali ed epidemiologici suggeriscono l’ipotesi che le modificazioni ossidative a carico dell’endotelio e delle lipoproteine a bassa densità (ox-LDL) rappresentano un fattore di cruciale importanza per l’iniziazione e la progressione dei processi aterosclerotici; preservare perciò l’integrità endoteliale e inibire la perossidazione delle LDL rappresenta una valida strategia per prevenire e, probabilmente, trattare l’aterosclerosi ed altri disordini cardiovascolari. Baicaleina (estratta da Scutellaria baicalensis G.), (-)-bilobalide (Ginkgo biloba L.), eupatorina (Eupatorium semiserratum D.C.), galangina (propoli), magnololo (Magnolia officinalis L.), miricetina (Myrica rubra S.Z.), oleuropeina (Olea europaea L.) e silibinina (Silybum marianum L.) sono composti di origine vegetale ampiamente utilizzati in medicina tradizionale nella cura di svariate malattie. Lo scopo di questo studio è stato focalizzato sulla determinazione della loro capacità antiradicalica, al fine di prevenire la formazione di ox-LDL ed attenuare la disfunzione endoteliale, ricorrendo all’impiego di diversi saggi in vitro ed ex vivo. Le proprietà antiradicaliche dei metaboliti secondari sono state inizialmente studiate ricorrendo ai saggi: a) dell’1,1-difenil-2-picrilidrazile (DPPH) scavenging assay, e b) dell’oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. Si tratta di metodi che si avvalgono di cinetiche di reazione basate sul trasferimento di singolo elettrone o mediante cessione di un atomo di idrogeno. Il DPPH scavenging assay è stato eseguito entro un intervallo di concentrazioni compreso tra 10^-7 M e 10^-2 M confermando una notevole capacità riducente per ciascun composto polifenolico, specialmente per miricetina, oleuropeina e baicaleina. L’analisi ORAC ha indicato come oleuropeina, miricetina e magnololo siano i composti più attivi. In entrambi i protocolli, il composto (-)-bilobalide non ha mostrato alcuna attività degna di nota. I processi di ossidazione delle LDL potrebbero, di fatto, rappresentare il nesso cruciale tra LDL plasmatiche ed aterogenesi: per questa ragione l'effetto antiossidante di ciascun composto è stato studiato in relazione alla suscettibilità delle LDL umane all'ossidazione. La determinazione del grado di ossidazione delle LDL è stata rilevata misurando la formazione di specie reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS), a seguito dell’incubazione con CuSO4 10 microM e monitorando il profilo cinetico di ossidazione delle LDL a 234 nm. I danni radicalici provocati a carico della frazione lipidica si traducono nella produzione di malondialdeide (MDA), una molecola in grado di reagire con l'acido tiobarbiturico in condizioni di alta temperatura ed acidità generando un addotto cromogeno; i composti oleuropeina 2.5 microM e baicaleina 5 microM hanno evidenziato i minori valori di TBARS, misurati come nMol MDA/mg LDL. Il profilo cinetico delle LDL trattate con ciascun fitocostituente è stato studiato ricorrendo all'indice di lag time. Alla concentrazione di 0.5 microM il magnololo, l’oleuropeina e la miricetina hanno mostrato un grado di protezione delle LDL significativamente più elevato rispetto agli altri polifenoli, con un notevole prolungamento della fase di latenza. Successivamente, si è passati allo studio delle colture primarie di cellule endoteliali umane isolate da vena ombelicale (HUVEC), per indagare la produzione di ROS. Le HUVEC rappresentano infatti un modello di fondamentale importanza nello studio di diversi processi patofisiologici correlati al sistema vascolare. L’attività degli antiossidanti nei confronti dello stress ossidativo è stata misurata nell’intervallo di concentrazione 0.01 - 5 microM mediante il saggio della diclorofluorescina, una sonda fluorimetrica impiegata per valutare la produzione intracellulare di perossidi. La determinazione delle specie reattive dell’ossigeno è stata condotta sia in condizioni basali, sia dopo l'aggiunta di H2O2 500 microM. In condizioni basali, i fitocostituenti hanno mostrato una modesta attività antiossidante mentre in condizioni di stress ossidativo indotto da H2O2, la galangina 5 microM ha dimostrato un più spiccato carattere antiossidante; anche la miricetina ha mostrato un profilo antiossidante significativo a 0.01 microM, 0.1 microM e 5 microM, anche se di minore entità. I risultati ottenuti in vitro suggeriscono che i polifenoli rappresentano una classe di composti naturali in grado di contrastare le disfunzioni ossidative legate all’aterosclerosi. Tali evidenze sperimentali incoraggiano la ricerca futura di derivati vegetali come efficaci agenti dotati di attività antiossidante anche in vivo, al fine di limitare la produzione di ox-LDL e fornire un adeguato presupposto per lo sviluppo di farmaci contro i danni provocati dalle specie radicaliche, in particolare a livello cardiovascolare.