Insight into the aggregation process of alpha-synuclein Structural study of alpha-synuclein covalent dimers

Riassunto La mia tesi di dottorato è composta di due sezioni. Una sezione riguarda la caratterizzazione di dimeri di alpha-sinucleina (aS) in confronto con le proprietà di aS, sia in soluzione che in esperimenti di aggregazione. Il lavoro sperimentale è stato condotto nel laboratorio di Chimica delle Proteine (CRIBI Biotechnology Center), presso l’Università degli studi di Padova, e costituisce il progetto principale nel quale sono stata coinvolta. Durante il mio terzo anno di dottorato ho trascorso 6 mesi al laboratorio Biopolymer Mass Spectrometry Laboratory presso l’Imperial College a Londra. In questo laboratorio sono stata coinvolta in due progetti: uno studio di analisi glicomica di tessuti murini e un progetto pilota sulla biosintesi di emicellulosa mixed linked glucans (MLG). Il morbo di Parkinson è una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata dalla perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra. La principale caratteristica istologica della malattia è la presenza di inclusioni intracellulari, conosciute come corpi di Lewy, composti da aggregati proteici filamentosi. La patogenesi della malattia è ancora poco chiara, ma un passaggio chiave nello sviluppo della malattia è l’aggregazione di alpha-synuclein (aS) in fibrille amiloidi, che si accumulano dei corpi di Lewy e ne costituiscono il componente principale. Nonostante la sua importanza nella neurodegenerazione, si conoscono poco la funzione di aS, il suo stato nativo fisiologico e il meccanismo di aggregazione. aS è stata di recente descritta come un tetramero di proteine in alpha-elica, ma aS è stata generalmente descritta come una proteina natively unfolded. aS assume conformazione ad alpha-elica a seguito di interazione con lipidi e converte a struttura beta durante i processi patologici. Durante il processo di aggregazione, aS forma oligomeri solubili di struttura beta, transienti intermedi tra la forma fisiologica di aS e le fibrille amiloidi. La dimerizzazione di aS può rappresentare un fattore limitante nell’aggregazione e nella formazione di struttura amiloide. Pertanto, abbiamo deciso di studiare l’aggregazione di diversi dimeri di aS, prodotti mediante biologia molecolare. E’ stato aggiunto un residuo di cisteina all’ N- o al C- terminale di aS, producendo quindi dimeri NN o CC, legati attraverso un legame disolfuro. Un dimero NC, formato da due molecole consecutive di aS, è stato ottenuto come singola catena polipeptidica. Durante il progetto è stato prodotto un altro dimero, chiamato DC, disegnato in modo da avvicinare ulteriormente le regioni idrofobiche di aS, ed evitare le interferenze provocate dalle catene laterali, che vengono a trovarsi all’interno della molecola nei dimeri NN, CC ed NC. Il dimero DC contiene i residui 1-104 uniti al segmento 29-140 di aS, ed è quindi costituito da due regioni centrali di aS, altamente amilodoigeniche, disposte in modo consecutivo. I dimeri rappresentano uno strumento adatto per lo studio delle interazioni intramolecolari di aS. Alcune differenze sostanziali definiscono e limitano la libertà di movimento dei dimeri rispetto ad aS, ipoteticamente differenziando il processo di fibrillazione delle cinque strutture proteiche. La caratterizzazione dei dimeri è stata effettuata utilizzando tecniche biofisiche e chimiche al fine di definire il loro comportamento in soluzione come monomero. Studi di dicroismo circolare (CD), spettroscopia IR ed NMR hanno dimostrato che tutti i dimeri sono unfolded. Tutti effettuano transizione ad alpha-elica a seguito dell’interazione con il detergente SDS. Questi risultati provano che i dimeri hanno caratteristiche conformazionali simili ad aS. Successivamente, è stata esaminata la capacità dei dimeri di formare fibrille, incubando le molecole in tampone fisiologico alla concentrazione di 1 mg/ml. Tiutti sono in grado di formare fibrille, che sono positive al saggio di legame alla Tioflavina T (ThT), generalmente utilizzato per determinare la presenza di struttura amiloide. Inoltre, le analisi della struttura delle fibrille, condotte usando CD e spettroscopia IR in trasformata di Fourier (FT-IR), rilevano la presenza di transizione strutturale da random a struttura beta come ci si aspetta per fibrille amiloidi. La morfologia delle fibrille è stata studiata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e microscopia di forza atomica (AFM). Le fibrille derivate dai dimeri di aS sono abbastanza lunghe, non ramificate e a singolo filamento, una differenza peculiare rispetto alle fibrille di aS, che si presentano twisted e formate da più filamenti. Per identificare quali amminoacidi di ciascun dimero fosse coinvolto nel core fibrillare sono sati eseguiti esperimenti di proteolisi. Il razionale di questo esperimento risiede nel fatto che le regioni non strutturate delle proteine sono in genere sito di attacco enzimatico, e l’idrolisi si verifica quindi in regioni flessibili, sprovviste di legani idrogeno intermolecolari che stabilizzano una struttura secondaria. Quindi lo scopo dell’esperimento è di rimuovere le parti flessibili dal core amyloide. I risultati hanno mostrato come le strutture core delle fibrille dei diversi dimeri sembrino essere costituite dalla stessa regione amminoacidica, che comprende il segmento 35-96, in analogia con studi precedenti su aS. La cinetica del processo è stata analizzata con tecniche di fluorescenza (saggio ThT) e valutando la quantità di proteine presenti nel tempo. Questo calcolo è stato effettuato indirettamente misurando l’assorbanza del surnatante ottenuto dopo ultracentrifugazione delle aliquote prelevate da miscele di aggregazione a diversi tempi. I dimeri NN ed NC hanno mostrato una cinetica di aggregazione più lenta rispetto ad aS, mentre il tasso di formazione delle fibrille di CC e DC è più veloce. Inoltre, esperimenti di aggregazione su miscele di aS in presenza di piccole quantità di dimeri sono stati condotti al fine di verificare se la presenza del dimero influenzasse la cinetica di aS. I risultati hanno evidenziato la capacità del dimero CC di influenzare l’aggregazione di aS. Sulla base dei risultati ottenuti, sono stati proposti dei modelli sulla conformazione dei dimeri all’interno delle fibrille. L’esperienza di ricerca svolta all’Imperial College London mi ha dato la possibilità di imparare e applicare tecniche avanzate di spettrometria di massa (MS) sull’analisi di composti organici, utilizzando gas cromatografia accoppiata ad MS (GC-MS) e spettrometri MALDI-TOF. L’enzima N-acetylglucosaminyltransferase V (GlcNAc-V), codificato dal gene Mgat 5, è un enzima del Golgi che catalizza l’addizione di un GlcNAc in posizione beta-1,6 a un mannosio alpha-1,6 della struttura di base degli zuccheri legati a residui amminici (N-glicani). GlcNAc-V svolge un ruolo fondamentale nella formazione di N-glicani a tre- e quattro-antenne su una proteina appena glicosilata. Queste ramificazioni forniscono il substrato favorito per la successiva sintesi enzimatica di catene poli-lactosamminiche e per le modificazioni terminali, compresi gli antigeni di Lewis. Ho svolto analisi glicomiche su tessuti renali murini per studiare possibili cambiamenti nella N-glicosilazione in topi wild type e knock out per il gene Mgat 5. In parallelo, è stato analizzato il profilo glicomico di tessuti renali e di milza di topi alimentati con una dieta ricca di GlcNAc. Risultati precedenti avevano dimostrato un aumento nel flussio di UDP-GlcNAc (substrato di GlcNAc-V), perciò eravamo interessati a determinare se il maggione apporto di zucchero influenzasse le glicosilazioni proteiche. I risultati hanno evidenziato come le glicoproteine dei topi ko per Mgat 5 hanno meno strutture a tre- e quattro-antenne nelle glicosilazioni rispetto ai controlli. L’apporto di GlcNAc nella dieta non ha alcun affetto apparente sulla struttura e composizione delle glicosilazioni dei tessuti analizzati, nonostante precedenti esperimenti condotti su linee cellulari abbiano avuto un diverso esito. Inoltre, le analisi che ho condotto hanno permesso di identificare glicosilazioni non ancora registrate nel database CFG (Consortium of Functional Glycomics) per i tessuti analizzati.