Structural and functional characterization of sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPases (SERCA)

Il Ca2+ è il più versatile tra i secondi messaggeri ed è responsabile del controllo di numerosi processi cellulari. Dalla crescita e proliferazione cellulare alla morte programmata, la sua versatilità è impiegata per regolare diverse tipologie di processi quali la contrazione muscolare, la secrezione, il metabolismo energetico e la plasticità sinaptica. Il coinvolgimento del calcio nel controllo di diversi aspetti della fisiologia cellulare richiede, pertanto, l’utilizzo di un sofisticato meccanismo basato su un set di componenti proteici (toolkit), in grado di usare le oscillazioni nella concentrazione del calcio come segnale per regolare una varietà di processi Ca2+ sensibili (Ca2+ sensitive processes). Tuttavia, le cellule non sono in grado di sostenere incrementi prolungati di calcio intracellulare. Per questo motivo le cellule eucariote hanno evoluto un efficiente sistema di trasporto (Ca2+ homeostasis) per mantenere la concentrazione intracellulare di calcio entro un intervallo tra i 20-100 nM. In risposta ad uno stimolo extracellulare, un rapido incremento del Ca2+ libero (500-1000 nM) produce un’immediata risposta cellulare tessuto-specifica, grazie all’abilità delle proteine che legano il calcio (Ca2+ sensitive proteins) di attivare diverse proteine bersaglio coinvolte in altre vie di segnalazione, in seguito al loro legame attraverso il motivo strutturale a mani EF. La coordinata rimozione del Ca2+ citosolico fuori dalla membrana plasmatica e dentro gli organelli interni (ER/SR) attraverso la pompa PMCA (Ca2+-ATPase della membrana plasmatica) e lo scambiatore Na+/Ca2+ e attraverso la pompa SERCA (Ca2+-ATPase del reticolo sarcoendoplasmatico) ripristina il livello basale del Ca2+. Il più specializzato meccanismo di coordinazione della rete di segnalazione del calcio può essere probabilmente trovato nel muscolo scheletrico, dove un aumento della concentrazione del Ca2+ produce la contrazione muscolare mentre la sua rimozione induce il rilassamento muscolare. Poiché negli umani circa il 70% del Ca2+ citosolico ritorna nel reticolo sarcoplasmatico (SR) e poiché quest’ultimo rappresenta la maggiore riserva di Ca2+, la pompa SERCA è conseguentemente coinvolta nella regolazione del meccanismo accoppiato di contrazione e rilassamento nel muscolo scheletrico e cardiaco. La proteina SERCA condivide le proprietà catalitiche del motivo ionico della famiglia delle P-type ATPasi, caratterizzata dalla formazione di un intermedio fosforilato, derivante dall’autofosforilazione di un residuo di aspartato nella loro sequenza altamente conservata. In sintesi, i membri della famiglia P-Type accoppiano il trasporto attivo di ioni attraverso la membrana all’idrolisi dell’ATP tramite un ciclo di reazione proposto 30 anni fa, chiamato Post-Albers cycle. Rispetto agli altri membri, la pompa SERCA si differenzia per la sua distribuzione tissutale, la regolazione, la specificità e il ruolo nell’omeostasi del calcio. Essa è codificata da una famiglia di tre geni, SERCA 1, 2, 3 e la variabilità delle sue isoforme è legata ad uno splicing alternativo del trascritto primario, specialmente al COOH-terminale. Finora, più di 10 isoforme sono state identificate a livello proteico, ma solo la struttura tridimensionale dell’isoforma1a di coniglio è stata determinata. La prima struttura cristallografica della SERCA, risolta dal gruppo di Toyoshima circa 13 anni fa, rappresenta una pietra miliare nella comprensione della macchina molecolare responsabile del trasporto attivo del calcio. Essa ha stabilito le basi per la costruzione di tutte le attuali conoscenze relative alla famiglia delle P-type ATP-asi. Da allora, i cristallografi hanno lavorato faticosamente nel cercare di chiarire il ciclo catalitico della pompa P-type. In particolare, due gruppi di ricerca (il gruppo di C. Toyoshima in Giappone e quello di Nissen in Danimarca) hanno mosso i loro sforzi verso la comprensione del meccanismo di trasporto ionico attivato dall’ATP, producendo e analizzando a livello atomico (2,3-3 A) le strutture cristallografiche di diversi intermedi della SERCA1a. I loro studi hanno aperto la strada ai recenti progressi nella cristallografia delle proteine di membrana. Infatti, circa 44 strutture della SERCA1a di coniglio, che cercano di simulare tutti gli stati conformazionali del ciclo enzimatico, sono state depositate nella Banca Dati Proteica (PDB) e la struttura tridimensionale della SERCA1a dal muscolo scheletrico continua ad essere considerata l’archetipo della famiglia della P-type ATPasi. Poiché le pompe SERCA svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell’omeostasi del calcio, variazioni nella loro attività proteica sono state identificate in due malattie umane associate a difetti nei geni codificanti per la pompa SERCA: la malattie di Brody e di Darier. La prima è una rara e recessiva condizione muscolare caratterizzata da una riduzione nel rilassamento muscolare indotta dall’esercizio. La causa della contrattura è associata ad una riduzione nell’attività della SERCA, derivante da un difetto nel gene codificante l’isoforma 1a (ATP2A1). Tuttavia, l’origine di questa riduzione è ancora controversa. La seconda patologia genetica, nota come malattia di Darier, è un raro disturbo autosomico dominante della pelle, caratterizzato da un’assenza di adesione tra le cellule e un’anomala cheratinizzazione dell’epidermide. Sono state identificate più di 130 mutazioni nel gene codificante per le isoforme 2a (ATP2A2) in pazienti umani. A differenza della malattia di Brody, i sintomi clinici, ristretti all’epidermide e a specifiche aree della pelle, probabilmente riflettono un mosaicismo di tipo genetico. Il nostro contributo strutturale alla comprensione degli effetti delle mutazioni puntiformi sulla conformazione proteica deriva dalla struttura cristallografica della pompa SERCA1a bovina, recentemente risolta a 2.9 Å di risoluzione. Poiché una mutazione da arginina a istidina nella posizione 164 è stata identificata in una mucca affetta da pseudo miotonia congenita e la stessa mutazione è stata identificata in un paziente ungherese affetto dalla malattia di Brody, questo animale potrebbe essere usato come modello compatibile allo studio delle patologie umane. Inoltre, questa struttura rappresenta la prima struttura cristallografica da una fonte diversa da quella di coniglio. La proteina è stata estratta da una porzione del muscolo Cutaneus trunci, che è stato omogeneizzato e solubilizzato con i detergenti deossicolato e C12E8. I cristalli proteici sono stati ottenuti tramite la tecnica dell’hanging drop con il metodo della diffusione di vapore e la struttura è stata risolta con il metodo della sostituzione molecolare. La raccolta dei dati cristallografici è stata eseguita nella struttura del sincrotrone europeo (ESRF) a Grenoble, Francia. Il fattore cristallografico R del modello strutturale raffinato è 0.23. Nel complesso il modello è simile a quello dell’enzima di coniglio, come atteso dall’alta identità della sequenza amminoacidica. Tuttavia, l’enzima bovino mostra una ridotta attività catalitica rispetto a quella del coniglio. Qualche piccola modificazione, in particolare nella regione del loop che protrude nel lume del reticolo sarcoplasmatico e che connette le α-eliche M7 e M8, potrebbe spiegare la differenza. Riguardo alle forme patologiche, poiché la mutazione è localizzata nel dominio A della pompa, cruciale nel ciclo di reazione, sulla base della nostra struttura è stato possibile fare delle speculazioni sugli effetti che la mutazione potrebbe produrre sulla conformazione proteica. Nello stato E1- AMMPPCP, il residuo di acido glutammico carico negativamente controbilancia la catena laterale protonata dell’Arg164 che agisce come perno centrale per tre differenti stiramenti del dominio A. La sostituzione della catena laterale dell’arginina con l’imidazolo del residuo d’istidina potrebbe destabilizzare la conformazione della pompa durante la transizione tra gli stadi E1-E2, aumentando probabilmente la suscettibilità della proteina alla degradazione proteolitica. Poiché lo scopo del mio progetto di dottorato è lo studio dei difetti genici responsabili delle malattie umane, l’isoforma SERCA2a rappresenta un altro importante bersaglio dei nostri studi strutturali. Questa proteina svolge un ruolo chiave nella regolazione del meccanismo accoppiato di contrazione e rilassamento del muscolo cardiaco. Risultati ottenuti da pazienti colpiti da infarto cardiaco e da modelli sperimentali hanno dimostrato che alterazioni nella regolazione del flusso di calcio sono associate a una ridotta contrattilità. Altre evidenze sembrano, inoltre, suggerire che alcune mutazioni nell’isoforma2a possono predisporre a malattie cardiache. Recentemente, la terapia di trasferimento genico della SERCA2a si è dimostrata sicura ed efficace nel ripristinare la funzione contrattile del cuore, attraverso l’over espressione della SERCA2a in condizioni fisiologiche e pato-fisiologiche. La determinazione della struttura cristallografica della SERCA2a potrebbe quindi aiutare a chiarire i meccanismi molecolari responsabili della disfunzione nel processo di segnalazione del calcio, così come aprire la possibilità di identificare e studiare gli inibitori proteici specifici per la SERCA2a. Nel nostro lavoro, l’isoforma2a umana è stata espressa in Saccharomyces cerevisiae come proteina ricombinante con un dominio accettore di biotina (BAD) legato al C-terminale (hSERCA2a-BAD) da un sito di taglio per la trombina. Poiché quest’ultimo era presente anche dentro la sequenza proteica, una mutazione puntiforme (R863G) è stata generata e la proteina è stata espressa con successo. In vivo, la biotinilazione del BAD aggiunto come sito “bersaglio” alla SERCA2a ha offerto sia una veloce ed efficiente strategia di purificazione che una selezione positiva dell’enzima propriamente foldato. Per ottenere una sufficiente quantità di enzima purificato in modo da realizzare prove di cristallizazione, in un reattore costruito in laboratorio, è stato ottimizzato un protocollo per la fermentazione in batch in S. cerevisiae. La proteina è stata quindi solubilizzata in un tampone con DDM alla appropriata concentrazione critica micellare. Alla fine, l’enzima è stato purificato attraverso la purificazione per affinità all’avidina, usando due differenti sistemi di purificazione (avidina coniugata alla resina e nano particelle rivestite di avidina). Per finire, un nuovo target è stato oggetto dei nostri studi strutturali: la proteina che lega il calcio EFHD2. Questa rappresenta una nuova proteina associata alla tau che è stata identificata nel modello sperimentale di topo (JNPL3), specifico per lo studio delle tauopatie. Il modello sperimentale sviluppa infatti neuro degenerazione in maniera dipendente dagli anni. Questa evidenza è stata anche riscontrata in pazienti affetti da Alzheimer, nei quali è risultata più elevata l’associazione tra la tau e la EFHD2. La proteina tau svolge un ruolo chiave nella comparsa delle tauopatie, che sono descritte come un gruppo di malattie neurologiche caratterizzate dall’aggregazione di proteine tau iperfosforilate e filamentose, organizzate in gomitoli di neurofibrille. Nonostante il processo di fosforilazione sia stato studiato intensivamente, il meccanismo molecolare alla base della neuro degenerazione mediato dalla tau è ancora poco studiato. L’identificazione della nuova proteina EFhd2 associata alla tau e la sua caratterizzazione strutturale potrebbero aiutare a chiarire i meccanismi responsabili delle tauopatie. Nel nostro lavoro, la proteina ricombinante EFhd2 umana è stata espressa in E. coli come proteina di fusione con un tag di istidine. La proteina è stata purificata, concentrata e usata per le prove di cristallizazione. Nonostante non siano ancora stati ottenuti cristalli diffrangenti, le prove preliminari appaiono veramente promettenti