Alfa-synuclein oligomers induced by docosahexaenoic acid: a study of activity and molecular characterization

Il morbo di Parkinson (PD) è la principale malattia neurodegenerativa riguardante la funzionalità motoria. L'1% della popolazione sopra i 65 anni è affetto da questa malattia. I sintomi principali sono bradichinesia, tremore a riposo, instabilità posturale, rigidità muscolare e, talvolta, problemi cognitivi e della personalità . Le principali caratteristiche neuropatologiche del PD sono la morte dei neuroni dopaminergici a livello della substantia nigra pars compacta e la formazione di corpi d'inclusione citoplasmatici composti da aggregati proteici fibrillari di tipo amiloide, Lewy bodies (LBs), il cui costituente principale è α-sinucleina (aS) (Spillantini et al., 1998). aS è proteina di 140 amminoacidi, natively unfolded, la cui funzione, nonostante il suo ruolo chiave nel PD, non è ancora completamente chiarita. E' espressa in livelli alti nel sistema nervoso centrale ed è abbondante nei terminali presinaptici neuronali. Strutturalmente è caratterizzata dalla presenza di sette ripetizioni imperfette di sequenza aminoacidica (KTKEGV) nella regione N-terminale, da una regione idrofobica centrale (NAC, non-amyloid component) e da una coda C-terminale con numerosi residui acidi. La sovraespressione di aS e mutazioni nel suo gene sono associati a forme precoci della sindrome di Parkinson. Il meccanismo con cui un cambiamento nella struttura e nell'espressione della proteina possa portare allo sviluppo della malattia non è ancora stato chiarito, ma è sempre pi๠accreditata l'ipotesi che siano le forme oligomeriche e non gli aggregati finali fibrillari ad essere responsabili della malattia. Il progetto di questa Tesi riguarda la caratterizzazione di oligomeri tossici di α-sinucleina (aS) ottenuti in presenza di acido docosaesaenoico (DHA) e lo studio della loro interazione con membrane lipidiche, allo scopo di comprendere il meccanismo con cui esercitano la loro tossicità . Il DHA è uno dei principali acido grassi cerebrali, strettamente correlato al PD e ad aS. L'esposizione di colture cellulari dopaminergiche a PUFAs porta all'accumulo di oligomeri solubili di aS, responsabili della citotossicità associata alla neurodegenerazione (Assayag et al., 2007). Esistono poi evidenze dell'implicazione di aS nella regolazione del metabolismo degli acidi grassi (Golovko et al., 2007). Inoltre è stato osservato che, nei pazienti affetti da PD, la presenza di DHA è maggiore nelle aree cerebrali contenenti inclusioni di aS. Studi in vivo, infine, hanno dimostrato che il DHA induce la formazione di oligomeri di aS (Sharon et al., 2003). In precedenti studi condotti nel laboratorio dove è stata svolta questa Tesi è stato analizzato il processo di aggregazione di aS in presenza di DHA, utilizzando due diversi rapporti molari proteina/acido grasso) (De Franceschi et al., 2009) e gli aggregati proteici ottenuti in queste condizioni sono stati caratterizzati da un punto di vista morfologico e strutturale (De Franceschi et al., 2011). E' stato osservato che la presenza di DHA in rapporto molare 50:1 rispetto alla proteina, porta alla formazione di oligomeri stabili, off-pathway nel processo di fibrillazione, che presentano una significativa attività tossica sulle cellule rispetto al monomero di aS. Nella prima parte di questa ricerca è stata condotta una caratterizzazione di queste specie oligomeriche che sono sufficientemente stabili nel tempo da consentire l'uso di diverse tecniche biofisiche. In particolare gli oligomeri sono stati analizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e a forza atomica (AFM), per studiare le dimensioni e la morfologia. Il tipo di struttura secondaria è stata valutata mediante dicroismo circolare che ha dimostrato un'altra peculiarità di questi oligomeri, ovvero la presenza di struttura parzialmente in α-elica, diversamente dalla maggior parte degli oligomeri descritti in letteratura. E' stata analizzata anche la capacità degli oligomeri di interagire con le membrane, utilizzando liposomi di diversa dimensione e diversa composizione e colture cellulari. L'interazione tra gli oligomeri e i liposomi, studiata mediante CD e saggi di leakage, causa il rilascio di piccole molecole interne alle vescicole, dimostrando così un loro effetto destabilizzante sulle membrane. L'attività degli oligomeri è stata anche testata su cellule in coltura che mostrano un'alterata permeabilità in loro presenza. Per determinare quale sia il meccanismo di destabilizzazione degli oligomeri, sono stati eseguiti vari saggi. Si è dimostrato tramite dynamic light scattering (DLS) e TEM che le vescicole, in seguito al legame con gli oligomeri, non vengono distrutte. Inoltre mediante studi di aggregazione e analisi su planar lipid membrane portano a ipotizzare un meccanismo di tossicità dovuto alla formazione di un'apertura transiente o un aumento di flip-flop a livello delle membrane. I risultati di questa parte di tesi sono oggetto di una pubblicazione (Fecchio et al., 2013). Un altro aspetto che è stato approfondito in questo lavoro di Tesi è lo studio degli oligomeri da un punto di vista chimico, allo scopo di caratterizzare le modifiche chimiche presenti sulla sequenza della proteina in seguito all'esposizione al DHA. Sono state evidenziate diverse modifiche mediante spettrometria di massa tra cui carbonilazioni e presenza di addotti. Quest'ultimo tipo di modifica in particolare avviene a livello dell'istidina in posizione 50. Per approfondire il ruolo di questo aminoacido nell'interazione con gli acidi grassi è stato studiato il mutante H50Q di aS. Questa proteina modificata è tra l'altro responsabile di forme familiari del PD. Infine è stata studiata anche l'interazione di altre varianti patologiche di aS associate a PD, A30P, E46K e A53T con DHA. In particolare, è stata analizzata la loro struttura e la loro tendenza ad aggregare in presenza di DHA, nonchè la loro capacità di formare oligomeri, in confronto ai risultati ottenuti con aS. In conclusione questo studio ha permesso di fornire maggiori informazioni sulla struttura e di studiare l'attività di specie oligomeriche che sono potenzialmente molto rilevanti per la patogenesi del PD. La struttura e l'attività di questi oligomeri potrà essere confrontata con quelle di oligomeri prodotti in diverse condizioni sperimentali o di oligomeri prodotti da altre proteine amiloidogeniche. Questa conoscenza è fondamentale per sviluppare agenti terapeutici che prevengano o debellino queste malattie debilitanti ed in continuo aumento