Biochemical and Chemical Biology Approaches to Investigate and Target the Mitochondrial GTPase OPA1

I mitocondri sono organuli citoplasmatici circondati da una doppia membrana deputati alla respirazione cellulare. Oltre alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, i mitocondri hanno un ruolo chiave nella regolazione dell’apoptosi essendo sede di accumulo di molti fattori che controllano i meccanismi di morte cellulare, come il citocromo c. I fattori apoptogenici sono contenuti all’interno di estroflessioni della membrana mitocondriale interna che costituiscono veri e propri compartimenti chiamati creste mitocondriali. Il rimodellamento delle creste controlla l’apertura delle stesse a livello di sottili connessioni dette giunzioni delle creste, con conseguente rilascio dei fattori apoptogenici. Un regolatore chiave di questi processi è OPA1, una proteina con un grande dominio GTPasico. In condizioni normali OPA1 forma complessi oligomerici a livello delle giunzioni delle creste che sono in grado di chiudere le creste tenendo sequestrato il citocromo c, ma in seguito a stimoli apoptotici gli oligomeri vengono destabilizzati consentendo l’apertura delle giunzioni e il rilascio dei fattori apoptogenici. Il ruolo di OPA1 nell’apoptosi è supportato da precedenti evidenze sperimentali che dimostrano che l’assenza di oligomeri di OPA1 favorisce l’induzione di apoptosi e al contrario l’aumento dei livelli di OPA1 riduce l’ampiezza delle creste ritardando l’innesco dei processi di morte cellulare. L’importanza di OPA1 nel controllo della morfologia mitocondriale è essenziale, inoltre, per la corretta formazione dei supercomplessi della catena respiratoria che risiedono nella membrana interna del mitocondrio e che regolano l’efficienza respiratoria. Infine è noto che OPA1 promuove la fusione mitocondriale cooperando con una proteina localizzata nella membrana mitocondriale esterna, Mitofusina 1 (MFN1). I mitocondri sono organelli molto versatili che, grazie ad eventi di fusione e fissione, sono in grado di modificare la propria struttura e morfologia a seconda delle condizioni cellulari. Le proteine che regolano questi eventi, localizzate sulle membrane esterna e interna del mitocondrio, appartengono alla famiglia delle dinamine. L’importanza fisiologica di OPA1 emerge dal fatto che mutazioni nel gene Opa1 causano l’atrofia dominante ottica (ADOA), la più frequente neuropatia ottica ereditaria, caratterizzata da progressiva riduzione dell’acuità visiva e atrofia temporale bilaterale del nervo ottico. I punti caldi di mutazione associati a questa patologia risiedono nel dominio GTPasico e nel dominio GED che si pensa abbia la funzione di idrolizzare il GTP in modo analogo ai fattori di scambio GTP-GDT (GEF). Lo scopo di questa tesi era quello di approfondire le conoscenze sulla funzione di Opa1 mediante approcci genetici e biochimici. In particolare è stato studiato l’effetto di mutazioni associate ad ADOA sulla funzionalità di Opa1 attraverso l’utilizzo di saggi in lievito. In un ceppo di lievito privo dell’omologo di Opa1, Mgm1, sono state espresse diverse varianti- malattia di Opa1. I lieviti sono stati fatti crescere in un terreno con fonte di carbonio non fermentabile (glicerolo) che forza i mitocondri a respirare attivamente e questa capacità di ricavare energia dalla respirazione richiede la funzionalità di Mgm1. L’espressione nel ceppo privo di Mgm1 di una forma ibrida Mgm1-Opa1 recupera il difetto di crescita e consente di analizzare l’effetto di differenti mutazioni nel gene Opa1. Parallelamente è stato messo a punto un sistema in vitro per studiare la cinetica delle forme mutanti rispetto alla forma funzionale di Opa1. E’ stato ottimizzato un protocollo per la purificazione di una forma ricombinante di Opa1 (rOpa1) che corrisponde alla forma solubile di Opa1 con un tag di istidine in posizione C-terminale che consentono la purificazione in colonna di affinità. Lo studio della cinetica enzimatica di questa proteina purificata ha consentito di dimostrare che la capacità di Opa1 di interagire è determinata primariamente dalla formazione di dimeri e quindi di tetrameri. Entrambi questi approcci sono stati utilizzati per studiare l’effetto di differenti mutazioni nel dominio GTPase e nel dominio GED associate a ADOA e ADOA plus, una forma più grave e sistemica della malattia, E’ stato osservato che mutazioni che causano la forma classica di ADOA determinano la perdita di funzione di Opa1 e mutazioni che determinano la forma sistemica di ADOA hanno un effetto dominante negativo sulla proteina funzionale. I dati di cinetica ci hanno permesso di identificare il difetto nella capacità di idrolisi e nella cinetica di interazione di Opa1. Mutazioni ADOA determinano una perdita di attività GTPasica che correla con una ridotta affinità per il GTP. Mutazioni ADOA plus mantengono invece questa funzionalità ma modificano lo scambio catalitico di GTP. Di conseguenza è possibile ipotizzare che mutanti ADOA non perdano la capacità di formare oligomeri con la forma funzionale della proteina ma ne impediscano la normale attività, mentre mutanti ADOA siano incapaci di oligomerizzare. Infatti mutanti ADOA plus agiscono come dominanti negativi sull’attività respiratoria e sulla morfologia mitochondriale quando co-espressi in lievito con la forma wild type mentre mutanti ADOA non hanno alcun effetto su questi parametri. I dati ottenuti nel nostro sistema sperimentale in lievito conducono alle stesse conclusioni. Questi risultati suggeriscono che mutazioni ADOA possano essere raggruppate sotto un aspetto biochimico sulla base del loro effetto sull’attività GTPasica. In generale inoltre è possibile concludere che questo saggio sperimentale costituisce un efficace strumento per valutare l’effetto di mutazioni in vivo e potrà essere utilizzato anche per analizzare l’impatto di nuove mutazioni di Opa1 sulla funzionalità della proteina Infine abbiamo studiato il ruolo di Opa1 nell’apoptosi allo scopo di identificare composti in grado di inibire l’attività di Opa1 come fattore atiapoptotico che favorisce il trattenimento del citocromo c nelle creste mitocondriali. La scoperta di tali composti potrebbe essere cruciale per mettere a punto nuove strategie per combattere il cancro. La proteina ricombinante rOpa1 purificata è stata utilizzata per misurare la sua capacità di idrolizzare GTP in presenza di diversi composti chimici. L’obiettivo era quello di identificare il maggior numero di composti in grado di inibire l’attività GTPasica di Opa1 misurando mediante saggio colorimetrico il rilascio di fosfato nella reazione di idrolisi GTP-GDP. Questo tipo di analisi era particolarmente importante visto che fino ad ora nessun composto era stato identificato come specifico inibitore di Opa1 e neppure nessun modello in silico della struttura di Opa1 era stato generato per poter valutare con modelli predittivi la possibile azione inibitoria di composti chimici. Dopo aver ripetuto due volte l’analisi, sono state identificate 8 sostanze in grado di inibire l’attività GTPasica di Opa1. Sulla base di specifici parametri questi composti sono stati suddivisi in due categorie: potenti inibitori quando l’attività di Opa1 è ridotta più del 50% e medi inibitori (riduzione dell’attività di Opa1 inferiore al 50%). Il fatto che non sia mai stata osservata un’inibizione totale dell’attività di Opa1 e che il coefficiente di Hill non raggiunga mai velori pari a 1 suggerisce che ci siano più enzimi con effetto ridondante sull’attività di Opa1. In particolare i nostri dati indicano che rOpa1 può assumere diverse conformazioni con relative a e specifica attività GTPasica. Esperimenti futuri saranno mirati a determinare come i diversi inibitori agiscono sulle differenti forme conformazionali di Opa1. Inoltre determineremo se questi composti hanno attività inibitoria su Opa1 anche in vivo.