Molecular studies for disclosing the genetic identity of local cultivars in olive and understanding the stilbene synthase pathway in grapevine

L’olivo e la vite sono l’oggetto della dissertazione, condotta da un punto di vista genetico e genomico, illustrata nel presente lavoro. L’olivo (Olea europaea L.) è uno degli alberi da frutto più antichi dell’intera area Mediterranea. Nonostante la crescente importanza economica di questa specie e la sempre più ampia diffusione di oli extra-vergine di oliva monovarietali, pochi sono gli studi riguardanti la caratterizzazione genetica degli alberi di olivo tipici della regione Veneto. Poiché la composizione e le proprietà sensoriali degli oli extra-vergine di oliva sono influenzate principalmente dal genotipo, la caratterizzazione di cultivar autoctone di olivo rappresenta una fase cruciale per la produzione, la commercializzazione e quindi l’autenticazione di oli d’oliva di alta qualità. A questo scopo, alcuni loci di marcatori microsatelliti mappati in varie regioni del genoma sono stati analizzati così da distinguere, sulla base di polimorfismi legati al DNA nucleare, diverse varietà di olivo coltivate in Veneto, dal lago di Garda fino a colli Trevigiani, passando per i colli Euganei, valutando così in modo sistematico l’intero germoplasma della regione. L’obiettivo finale del presente lavoro è stato risolvere alcuni casi omonimia e sinonimia nonché garantire l’autenticità di cultivar di olivo e dei loro cloni. Un totale di 204 accessioni prive di una chiara assegnazione varietale e 25 varietà di referenza sono state analizzate saggiando 10 marcatori microsatelliti di loci nucleari altamente polimorfici. Un’analisi della struttura genetica della popolazione è stata eseguita al fine di definire il numero di gruppi e la loro diversità genetica. Sulla base dei coefficienti di similarità genetica, una cospicua parte delle accessioni (60 campioni) si è dimostrata geneticamente identica alla varietà di referenza “Casaliva” mentre altri genotipi sono risultati geneticamente identici a varietà nazionali e locali tra cui “Miniol” (21 campioni), “Grignano” (20 campioni), “Tonda di Villa” (19 campioni), “Leccino” e “Capolga” (17 campioni ciascuna), “Gargnà”, “Compostaro” e “Oblica” (9 campioni ciascuna), “Rossanel” (8 campioni), “Fort” e “Baia” (5 campioni ciascuna), “Grappolo” e “Favarol” (3 campioni ciascuna), con supporto statistico di bootstrap superiore all’85%. Soltanto sei campioni, due per ciascuna cultivar, si sono rivelati attribuibili a “Moraiolo”, “Carnica” and “Maurino”. L’analisi della struttura genetica della popolazione analizzata ha evidenziato di essere costituita da 15 sottogruppi. Merita sottolineare che più del 98% delle accessioni ha mostrato una netta appartenenza ad uno di questi sottogruppi e solo 13 accessioni hanno rivelato una discendenza mista, con valori di appartenenza ad uno dei sottogruppi inferiore al 70%. La quota totale di eterozigosi osservata è risultato pari a Ho = 91,6% (st. dev. 1,9%) mentre l’eterozigosi media attesa è risultata pari a He = 74,1% (st. dev. 2,9%). L’indice di diversità genetica di Nei è risultato pari a uHe=74,3% mentre l’indice di Shannon sulla diversità fenotipica dei profili molecolari è risultato pari a I=1.612. Tutti i coefficienti di inbreeding di Wright si sono rivelati negativi e, in media, uguali a -0,863 (Fis) e -0,159 (Fit). Nel complesso i marcatori microsatelliti impiegati in questo studio si sono dimostrati estremamente efficienti nella risoluzione dei casi di omonimia, sinonimia ed errata identificazione consentendo così la prima vera analisi sistematica del germoplasma di olivo della regione Veneto finalizzata alla valorizzazione delle varietà locali più adatte alla produzione di oli di oliva monovarietali. Il secondo capitolo del presente lavoro si è focalizzato sulla pianta della vite ed in particolare sugli stilbeni, un gruppo di composti secondari appartenenti alla famiglia dei fenilpropanoidi accumulati in un numero limitato di piante (72) tra cui vite. Generalmente questa classe di fenilpropanoidi è accumulata nelle foglie, nelle radici e nei frutti in risposta a stress abiotici e biotici quali ferita, esposizione a raggi UV-C, infezione da patogeni e trattamenti chimici. Negli ultimi decenni l’interesse verso gli stilbeni è andato progressivamente aumentando, non solo in virtù del ruolo fondamentale che assumono nella difesa della pianta da stress ambientali, ma anche per le loro proprietà farmacologiche. La via metabolica dedita alla produzione di questi composti rappresenta una diramazione della pathway biosintetica che porta alla produzione dei fenilpropanoidi e può essere considerata un’estensione della via metabolica che flavonoidi. La stilbene sintasi è l’enzima chiave nella produzione di resveratrolo, composto alla base della biosintesi degli stilbeni complessi. Recentemente abbiamo identificato e caratterizzato funzionalmente due fattori di trascrizione di tipo R2R3-MYB che, in vite, sono direttamente coinvolti nella regolazione della via metabolica degli stilbeni. Questi fattori di trascrizione, denominati VvMYB14 e VvMYB15, co-esprimono con le VvSTS in diverse condizioni di stress (stress meccanico, radiazioni UV-C, attacco fungino) e in alcune fasi di sviluppo del seme e della bacca. In saggi reporter, MYB14 e MYB15 hanno mostrato un coinvolgimento diretto nell’attivazione dei promotori dei geni VvSTS e l’espressione ectopica di VvMYB15 in hairy root ha rivelato un incremento nell’espressione dei geni VvSTS nonché l’accumulo di stilbeni glicosilati (piceidi) in planta. Tuttavia, nonostante i risultati incoraggianti, diverse sono le questioni rimaste insolute in relazione a questa via biosintetica. Partendo dal presupposto che geni coinvolti in processi affini o strettamente correlati possono esibire, in condizioni sperimentali controllate, profili di espressione simili, alcune analisi di co-espressione, eseguite su alcuni dataset di espressione in vite, hanno permesso di identificare fattori di trascrizione candidati, appartenenti alla famiglia WRKY, che potrebbero essere coinvolti nella regolazione della via biosintetica degli stilbeni. Questi geni hanno mostrato valori di correlazione, in termini di co-espressione, persino più alti di quelli osservati per VvMYB14 e VvMYB15 e si sono rivelati marcatamente indotti a seguito degli stessi stress che portano all’induzione di VvSTS e dei MYB14/15. Le analisi di correlazione su database pubblici, la validazione della co-espressione dei WRKY candidati e VvSTSs in diverse cinetiche di stress e la caratterizzazione funzionale tramite saggio luciferasi in colture cellulari di vite hanno permesso di aggiungere nuovi tasselli ai meccanismi regolatori che stanno alla base della pathway biosintetica che porta alla sintesi degli stilbeni.