Una caratteristica peculiare dell'organizzazione topografica del bulbo olfattivo (OB) è il "duplice ruolo" dei recettori olfattivi (OR). Esso, infatti, non è unicamente coinvolto nella percezione degli odori, ma svolge anche un ruolo cruciale nella convergenza assonale di neuroni sensoriali olfattivi (OSN) esprimenti lo stesso OR, nella formazione di glomeruli in specifiche regioni del OB. Tale organizzazione delle afferenze sensoriali dà origine alla mappa sensoriale. Ciò nonostante, il meccanismo attraverso cui l'OR svolga queste due distinte funzioni è rimasto sconosciuto per più di 20 anni. Se l'OR svolgesse uan funzione nella convergenza assonale, potrebbe agire come "axon guidance", molecole guida, per gli assoni stessi. A sostegno di questa ipotesi, è stato dimostrato che l'OR è espresso non solo alle cilia del neurone sensoriale olfattivo, ma anche nell'assone terminale, assumendo quindi una posizione ottimale per guidarne il movimento. Il loro meccanismo di attivazione, così come la loro funzione all'assone terminale, rimane però sconosciuta. I recettori olfattivi (OR) espressi nelle ciglia, sono recettori accoppiati a proteine G che, in seguito al legame con molecole odorose, attivano una specifica proteina G, Golf, che stimola l'adenilato ciclasi di tipo III (ACIII) a produrre AMP ciclico (cAMP). Quest'ultimo induce l'apertura di specifici canali regolati da nucleotidi ciclici chiamati "cyclic nucleotide-gated (CNG)", con conseguente influsso di ioni Ca2+e Na+ nel citoplasma della cellula. Tale aumento intracellulare di Ca2+ attiva canali di Cl- che, permettendo l'uscita di ioni Cl- dal citoplasma, depolarizzando la cellula. Recentemente, il gruppo della Dott.ssa Lodovichi ha dimostrato per la prima volta che il recettore olfattivo espresso all'assone terminale (cono di crescita) dei OSN è funzionale e accoppiato ad un locale incremento di cAMP e Ca2+. Ca2+ e cAMP sono due secondi messaggeri che svolgono un ruolo chiave nell'allungamento e nel "turning" movimento assonale in diversi sistemi, compreso il sistema olfattivo, in cui è stato dimostrato che cAMP che si produce in seguito all'attivazione del recettore olfattivo contribuisca a formare i glomeruli in una specifica posizione nell' OB. Il punto critico che rimane da affrontare e definire è il meccanismo di attivazione e la funzione del recettore olfattivo espresso all'assone terminale dei OSN. In particolare: Quali siano i ligandi naturali espressi all'assone terminale? Un gruppo ristretto di molecole espresse nel bulbo potrebbero legare e attivare il recettore olfattivo espresso all'assone terminale. Al fine di verificare questa ipotesi il gruppo della Dottoressa Lodovichi è stato in grado di identificare un gruppo di molecole (mediante tecniche cromatografiche) estratte da bulbi olfatti di ratti embrionali e ne ha testato la capacità di attivare l'OR all'assone terminale. Attraverso la tecnica dell'imaging del calcio in neuroni sensoriali olfattivi, il gruppo della Dott.ssa Lodovichi ha osservato che un gruppo di molecole applicate localmente, è in grado di attivare i neuroni sensoriali olfattivi, determinando una risposta di calcio all'assone terminale. Mediante spettrometria di massa delle molecole in grado di attivare l'OR è stato identificato un possibile ligando dell'OR espresso all'assone terminale dei OSN. Si tratta di una proteina, apparentemente alla famiglia delle etanolammine, chiamato phosphatidylethanolamine-binding protein-1 (PEBP1) o inibitore delle Raf chinasi (RKIP). PEBP1 è una proteina di circa ~21 KDa che appartiene ad una famiglia di proteine molto conservata espressa in diversi tessuti di diverse specie. Nei roditori PEBP1 è espressa in diverse aree cerebrali, sia in neuroni che in cellule non neuronali. La funzione fisiologica di PEBP1 nel cervello rimane tuttavia non nota . Il suo basso peso molecolare, il fatto che venga secreta, che moduli i recettori accoppiati a proteine G, nonchè la presenza di deficit olfattivi in linee di topo che possiedono mutazioni di PEBP1 (topi PEBP1 -/-), rendono PEBP1 un possibile ligando del recettore olfattivo. Durante il mio lavoro di tesi di dottorato ho investigato se e in che modo PEBP1 potesse attivare l'OR e il suo contributo nella formazione della mappa sensoriale olfattiva. Come primo step, sono state studiate le dinamiche del calcio in risposta a PEBP1 sia nei neuroni sensoriali di ratto che di topo, caricati con l'indicatore di calcio, fura-2. Questi esperimenti hanno permesso di identificare risposte calcio in seguito all'applicazione di PEBP1 all'assone terminale di OSN di ratto embrionale mediante una pipetta di vetro. Degno di nota è che PEBP1, estratto dal bulbo olfattivo di ratto è in grado di indurre risposte calcio anche in OSN di topo. Questa evidenza suggerisce che l'aumento di calcio in risposta all'applicazione di PEBP1 è altamente conservata tra le specie. Al fine di verificare che l'aumento di calcio in risposta di PEBP1 osservato in OSN fosse dovuto all'attivazione di OR, esperimenti di calcium imaging sono stati effettuati in linee cellulari derivate da cellule endoteliari di rene embrionale umano (HEK293T). Alle linee cellulari HEK, trasfettate con uno specifico OR (OREG, P2, S6, Olfr62, M72) caricate con l'indicatore per il calcio fura-2, è stato applicato PEBP1 e il corrispondente odore del OR trasfettato. Nelle linee cellulari HEK293T trasfettate con specifici OR (OREG, P2, S6, Olfr62) è stata osservata un'immediata risposta di calcio intracellulare in seguito sia all'applicazione di PEBP1 che dell'odore specifico del OR trasfettato usato come controllo); Un' eccezione è stata riscontrata in HEK293T esprimenti il recettore M72 che sono responsive soltanto per l'odore specifico di M72 (Methylsalicilate) ma non a PEBP1. Questo risultato suggerisce la presenza di altre molecole, oltre che a PEBP1, che possano attivare l'OR. Inoltre, in HEK293T trasfettate con il solo vettore pCI, non esprimente l' OR, non è stato osservato alcun aumento di calcio intracellulare nè in risposta a PEBP1, nè all'odore specifico del OR trasfettato, ma solamente in risposta al carbacolo, usato come test di vitalità cellulare. Questi risultati mettono in evidenza che l'aumento di calcio intracellulare in seguito all'applicazione di PEBP1 è dovuto all'attivazione del OR. Tuttavia, PEBP1 denaturato mediante alte temperature o con proteinase K non determina alcuna risposta di calcio intracellulare in HEK293T trasfettate con OR specifico. Al fine di escludere che la presenza di contaminanti nella procedura di purificazione, possa indurre una risposta calcio nelle linee cellulari HEK esprimenti uno specifico OR è stato applicata un'altra proteina chinasi 2 ciclina-dipendente (CDK2), purificata con lo stesso protocollo di PEBP1. Nessuna risposta di calcio intracellulare è stata osservata confermando la specificità di risposta di PEBP1. Molecole guida "axon guidance" dirigono l'allungamento assonale. Al fine di investigare se PEBP1 fosse in grado di modulare il movimento assonale, è stato valutato il comportamento del cono di crescita mediante la tecnica di " time-lapse imaging"sul singolo assone in risposata a gradienti di molecole in grado di modulare il signaling dei secondi messaggeri cAMP e Ca2+ all'assone terminale (es. foscolina). Abbiamo osservato che PEBP1 regola il movimento dell'assone di OSN con un simile effetto della foscolina o degli odori, capaci di modulare i livelli di cAMP e Ca2+ al cono di crescita del neurone sensoriale olfattivo. Dov'è espresso PEBP1 nel bulbo olfattivo? Mediante la tecnica di immunofluorescenza su sezioni di OB di ratto embrionale, postanatale e di topo, è stata osservata l'espressione di PEBP1 nelle cellule periglomerulari, un' ottima posizione per guidare gli assoni degli OSN. PEBP1 è espresso con un pattern discontinuo, maggiormente nella regione anteriore (A), mediale (M) e laterale (L) dell'OB mentre è difficile osservare cellule positive per PEBP1 nella zona posteriore (P). Mediante immunofluorescenza, RT-PCR e western blot è stato osservata l'assenza di espressione di PEBP1 nei OSN localizzati nell'epitelio olfattivo (MOE) di ratti embrionali, postnatali e di topo. In accordo con queste evidenze, PEBP1 non è espresso nel "cuore" dei glomeruli. Per tutte queste tecniche, tessuti provenienti da una linea di topo con mutazioni per PEBP1 (topi PEBP1-/-) sono stati utilizzati come controlli negativi. Se PEBP1 giocasse un ruolo importante nell' organizzazione e nella posizione dei glomeruli nel bulbo olfattivo (OB), linee di topi che presentano mutazioni per questa proteina (topi PEBP1-/-), dovrebbero mostrare alterazioni nella mappa sensoriale. Al fine di verificare questa ipotesi, i topi che presentano mutazioni per PEBP1 (topi PEBP1-/-) sono stati incrociati per linee di topi in cui uno specifico OR è co-espresso con una proteina fluorescente, GFP (es. come le linee di topi P2-GFP , M72–YFP). In queste linee di topi è stata studiata la convergenza delle fibre positive per la proteina fluorescente (GFP) nella formazione dei glomeruli nell'OB. La convergenza assonale dei OSN esprimenti il recettore P2-OR è distrutta dalla presenza di numerosi glomeruli eterogenei, mentre quella delle fibre esprimenti il recettore M72 (non responsivo a PEBP1 in vitro) non è alterata. Degno di nota è che l'alterazione nell'organizzazione topografica della mappa sensoriale è maggiormente evidente nei topi omozigoti per la mutazione di PEBP1 rispetto ai topi eterozigoti, suggerendo un meccanismo dosaggio dipendente. Successivamente, è stata valutata la posizione di specifici glomeruli nel OB, un punto cruciale della mappa topografica. Nessun difetto è stato riportato lungo l'asse dorso-ventrale (D-V) del bulbo, in accordo con la presenza di altre molecole che guidano le afferenze assonali dei OSN nella formazione dei glomeruli in una specifica posizione lungo l'asse dorso-ventrale del OB. La posizione del glomerulo M72 non differisce tra i topi PEBP1-/- e controlli. Questo dato è in accordo con una normale organizzazione dei glomeruli in cui convergono le fibre-M72 e con i dati in vitro in cui il recettore P2 ma non M72 è responsivo per PEBP1. Al fine di investigare l'effetto funzionale dell'alterazione della mappa sensoriale è stato effettuato un test olfattivo (habituation-dishabituation test) nei topi PEBP1-/-. E' stato riscontrato un deficit olfattivo nel riconoscimento e discriminazione degli odori nei topi PEBP1-/- rispetto ai controlli. Tutti i dati raccolti in questa tesi di Dottorato suggeriscono che OR espressso all'assone terminale può agire come molecola guida attivate dal ligando naturale del OR identificato PEBP1.
The odorant receptor expressed at the axon terminal of olfactory sensory neurons: mechanism of activation and function
FRANCIA, SIMONA
2018
Abstract
Una caratteristica peculiare dell'organizzazione topografica del bulbo olfattivo (OB) è il "duplice ruolo" dei recettori olfattivi (OR). Esso, infatti, non è unicamente coinvolto nella percezione degli odori, ma svolge anche un ruolo cruciale nella convergenza assonale di neuroni sensoriali olfattivi (OSN) esprimenti lo stesso OR, nella formazione di glomeruli in specifiche regioni del OB. Tale organizzazione delle afferenze sensoriali dà origine alla mappa sensoriale. Ciò nonostante, il meccanismo attraverso cui l'OR svolga queste due distinte funzioni è rimasto sconosciuto per più di 20 anni. Se l'OR svolgesse uan funzione nella convergenza assonale, potrebbe agire come "axon guidance", molecole guida, per gli assoni stessi. A sostegno di questa ipotesi, è stato dimostrato che l'OR è espresso non solo alle cilia del neurone sensoriale olfattivo, ma anche nell'assone terminale, assumendo quindi una posizione ottimale per guidarne il movimento. Il loro meccanismo di attivazione, così come la loro funzione all'assone terminale, rimane però sconosciuta. I recettori olfattivi (OR) espressi nelle ciglia, sono recettori accoppiati a proteine G che, in seguito al legame con molecole odorose, attivano una specifica proteina G, Golf, che stimola l'adenilato ciclasi di tipo III (ACIII) a produrre AMP ciclico (cAMP). Quest'ultimo induce l'apertura di specifici canali regolati da nucleotidi ciclici chiamati "cyclic nucleotide-gated (CNG)", con conseguente influsso di ioni Ca2+e Na+ nel citoplasma della cellula. Tale aumento intracellulare di Ca2+ attiva canali di Cl- che, permettendo l'uscita di ioni Cl- dal citoplasma, depolarizzando la cellula. Recentemente, il gruppo della Dott.ssa Lodovichi ha dimostrato per la prima volta che il recettore olfattivo espresso all'assone terminale (cono di crescita) dei OSN è funzionale e accoppiato ad un locale incremento di cAMP e Ca2+. Ca2+ e cAMP sono due secondi messaggeri che svolgono un ruolo chiave nell'allungamento e nel "turning" movimento assonale in diversi sistemi, compreso il sistema olfattivo, in cui è stato dimostrato che cAMP che si produce in seguito all'attivazione del recettore olfattivo contribuisca a formare i glomeruli in una specifica posizione nell' OB. Il punto critico che rimane da affrontare e definire è il meccanismo di attivazione e la funzione del recettore olfattivo espresso all'assone terminale dei OSN. In particolare: Quali siano i ligandi naturali espressi all'assone terminale? Un gruppo ristretto di molecole espresse nel bulbo potrebbero legare e attivare il recettore olfattivo espresso all'assone terminale. Al fine di verificare questa ipotesi il gruppo della Dottoressa Lodovichi è stato in grado di identificare un gruppo di molecole (mediante tecniche cromatografiche) estratte da bulbi olfatti di ratti embrionali e ne ha testato la capacità di attivare l'OR all'assone terminale. Attraverso la tecnica dell'imaging del calcio in neuroni sensoriali olfattivi, il gruppo della Dott.ssa Lodovichi ha osservato che un gruppo di molecole applicate localmente, è in grado di attivare i neuroni sensoriali olfattivi, determinando una risposta di calcio all'assone terminale. Mediante spettrometria di massa delle molecole in grado di attivare l'OR è stato identificato un possibile ligando dell'OR espresso all'assone terminale dei OSN. Si tratta di una proteina, apparentemente alla famiglia delle etanolammine, chiamato phosphatidylethanolamine-binding protein-1 (PEBP1) o inibitore delle Raf chinasi (RKIP). PEBP1 è una proteina di circa ~21 KDa che appartiene ad una famiglia di proteine molto conservata espressa in diversi tessuti di diverse specie. Nei roditori PEBP1 è espressa in diverse aree cerebrali, sia in neuroni che in cellule non neuronali. La funzione fisiologica di PEBP1 nel cervello rimane tuttavia non nota . Il suo basso peso molecolare, il fatto che venga secreta, che moduli i recettori accoppiati a proteine G, nonchè la presenza di deficit olfattivi in linee di topo che possiedono mutazioni di PEBP1 (topi PEBP1 -/-), rendono PEBP1 un possibile ligando del recettore olfattivo. Durante il mio lavoro di tesi di dottorato ho investigato se e in che modo PEBP1 potesse attivare l'OR e il suo contributo nella formazione della mappa sensoriale olfattiva. Come primo step, sono state studiate le dinamiche del calcio in risposta a PEBP1 sia nei neuroni sensoriali di ratto che di topo, caricati con l'indicatore di calcio, fura-2. Questi esperimenti hanno permesso di identificare risposte calcio in seguito all'applicazione di PEBP1 all'assone terminale di OSN di ratto embrionale mediante una pipetta di vetro. Degno di nota è che PEBP1, estratto dal bulbo olfattivo di ratto è in grado di indurre risposte calcio anche in OSN di topo. Questa evidenza suggerisce che l'aumento di calcio in risposta all'applicazione di PEBP1 è altamente conservata tra le specie. Al fine di verificare che l'aumento di calcio in risposta di PEBP1 osservato in OSN fosse dovuto all'attivazione di OR, esperimenti di calcium imaging sono stati effettuati in linee cellulari derivate da cellule endoteliari di rene embrionale umano (HEK293T). Alle linee cellulari HEK, trasfettate con uno specifico OR (OREG, P2, S6, Olfr62, M72) caricate con l'indicatore per il calcio fura-2, è stato applicato PEBP1 e il corrispondente odore del OR trasfettato. Nelle linee cellulari HEK293T trasfettate con specifici OR (OREG, P2, S6, Olfr62) è stata osservata un'immediata risposta di calcio intracellulare in seguito sia all'applicazione di PEBP1 che dell'odore specifico del OR trasfettato usato come controllo); Un' eccezione è stata riscontrata in HEK293T esprimenti il recettore M72 che sono responsive soltanto per l'odore specifico di M72 (Methylsalicilate) ma non a PEBP1. Questo risultato suggerisce la presenza di altre molecole, oltre che a PEBP1, che possano attivare l'OR. Inoltre, in HEK293T trasfettate con il solo vettore pCI, non esprimente l' OR, non è stato osservato alcun aumento di calcio intracellulare nè in risposta a PEBP1, nè all'odore specifico del OR trasfettato, ma solamente in risposta al carbacolo, usato come test di vitalità cellulare. Questi risultati mettono in evidenza che l'aumento di calcio intracellulare in seguito all'applicazione di PEBP1 è dovuto all'attivazione del OR. Tuttavia, PEBP1 denaturato mediante alte temperature o con proteinase K non determina alcuna risposta di calcio intracellulare in HEK293T trasfettate con OR specifico. Al fine di escludere che la presenza di contaminanti nella procedura di purificazione, possa indurre una risposta calcio nelle linee cellulari HEK esprimenti uno specifico OR è stato applicata un'altra proteina chinasi 2 ciclina-dipendente (CDK2), purificata con lo stesso protocollo di PEBP1. Nessuna risposta di calcio intracellulare è stata osservata confermando la specificità di risposta di PEBP1. Molecole guida "axon guidance" dirigono l'allungamento assonale. Al fine di investigare se PEBP1 fosse in grado di modulare il movimento assonale, è stato valutato il comportamento del cono di crescita mediante la tecnica di " time-lapse imaging"sul singolo assone in risposata a gradienti di molecole in grado di modulare il signaling dei secondi messaggeri cAMP e Ca2+ all'assone terminale (es. foscolina). Abbiamo osservato che PEBP1 regola il movimento dell'assone di OSN con un simile effetto della foscolina o degli odori, capaci di modulare i livelli di cAMP e Ca2+ al cono di crescita del neurone sensoriale olfattivo. Dov'è espresso PEBP1 nel bulbo olfattivo? Mediante la tecnica di immunofluorescenza su sezioni di OB di ratto embrionale, postanatale e di topo, è stata osservata l'espressione di PEBP1 nelle cellule periglomerulari, un' ottima posizione per guidare gli assoni degli OSN. PEBP1 è espresso con un pattern discontinuo, maggiormente nella regione anteriore (A), mediale (M) e laterale (L) dell'OB mentre è difficile osservare cellule positive per PEBP1 nella zona posteriore (P). Mediante immunofluorescenza, RT-PCR e western blot è stato osservata l'assenza di espressione di PEBP1 nei OSN localizzati nell'epitelio olfattivo (MOE) di ratti embrionali, postnatali e di topo. In accordo con queste evidenze, PEBP1 non è espresso nel "cuore" dei glomeruli. Per tutte queste tecniche, tessuti provenienti da una linea di topo con mutazioni per PEBP1 (topi PEBP1-/-) sono stati utilizzati come controlli negativi. Se PEBP1 giocasse un ruolo importante nell' organizzazione e nella posizione dei glomeruli nel bulbo olfattivo (OB), linee di topi che presentano mutazioni per questa proteina (topi PEBP1-/-), dovrebbero mostrare alterazioni nella mappa sensoriale. Al fine di verificare questa ipotesi, i topi che presentano mutazioni per PEBP1 (topi PEBP1-/-) sono stati incrociati per linee di topi in cui uno specifico OR è co-espresso con una proteina fluorescente, GFP (es. come le linee di topi P2-GFP , M72–YFP). In queste linee di topi è stata studiata la convergenza delle fibre positive per la proteina fluorescente (GFP) nella formazione dei glomeruli nell'OB. La convergenza assonale dei OSN esprimenti il recettore P2-OR è distrutta dalla presenza di numerosi glomeruli eterogenei, mentre quella delle fibre esprimenti il recettore M72 (non responsivo a PEBP1 in vitro) non è alterata. Degno di nota è che l'alterazione nell'organizzazione topografica della mappa sensoriale è maggiormente evidente nei topi omozigoti per la mutazione di PEBP1 rispetto ai topi eterozigoti, suggerendo un meccanismo dosaggio dipendente. Successivamente, è stata valutata la posizione di specifici glomeruli nel OB, un punto cruciale della mappa topografica. Nessun difetto è stato riportato lungo l'asse dorso-ventrale (D-V) del bulbo, in accordo con la presenza di altre molecole che guidano le afferenze assonali dei OSN nella formazione dei glomeruli in una specifica posizione lungo l'asse dorso-ventrale del OB. La posizione del glomerulo M72 non differisce tra i topi PEBP1-/- e controlli. Questo dato è in accordo con una normale organizzazione dei glomeruli in cui convergono le fibre-M72 e con i dati in vitro in cui il recettore P2 ma non M72 è responsivo per PEBP1. Al fine di investigare l'effetto funzionale dell'alterazione della mappa sensoriale è stato effettuato un test olfattivo (habituation-dishabituation test) nei topi PEBP1-/-. E' stato riscontrato un deficit olfattivo nel riconoscimento e discriminazione degli odori nei topi PEBP1-/- rispetto ai controlli. Tutti i dati raccolti in questa tesi di Dottorato suggeriscono che OR espressso all'assone terminale può agire come molecola guida attivate dal ligando naturale del OR identificato PEBP1.File | Dimensione | Formato | |
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