Studying oxygenases of biocatalytic interest

Sommario La tesi si divide in tre capitoli. Il primo capitolo tratta della caratterizzazione biochimica e biocatalitica di una nuova Baeyer-Villiger monoossigenasi dall’ Archea alofilico Haloterrigena turkmenica. Il secondo capitolo tratta lo studio del ruolo funzionale di due Baeyer-Villiger monossigenasi da organismi fotosintetici: il muschio Physcomitrella patens e l’alga rossa Cyanidioschyzon merolae. Il terzo capitolo tratta lo studio dell’espressione ricombinante e dell’attività di ossigenasi di CCDs (carotenoid cleavage oxygenases) coinvolte nella biosintesi dello zafferano in Crocus sativus. 1.1 Capitolo I Le Baeyer-Viliger monoossigenasi (BVMOs) sono biocatalizzatori che sono in grado di produrre esteri chirali o lattoni a partire da chetoni. Come catalizzatori possono svolgere un ruolo equivalente a quello dei peracidi che sono convenzionalmente utilizzati in chimica organica sintetica, ossia quello di rompere il legame C-C di molecole organiche inserendo un atomo di ossigeno. In questo studio il gene codificante la putativa Baeyer-Villiger monoossigenasi da Haloterrigena turkmenica (Ht), un Archaea alofilo originario del terreno solforico delle saline del Turkmenistan, è stato clonato ed espresso in E. coli. La proteina ricombinante, Ht-BVMO, è stata purificata e caratterizzata biochimicamente. Questa nuova BVMO è il primo enzima di questa classe identificato in un Archaea. La particolare composizione amminoacidica di questa BVMO è coerente con quella di altri enzimi alofili, ed è caratterizzata da un’alta percentuale di amminoacidi carichi negativamente sulla superficie che hanno la funzione di prevenire l’aggregazione proteica in presenza di alte concentrazioni di sale. Alcuni substrati chetonici, considerati substrati standard delle BVMOs, sono stati testati in saggi enzimatici e l’effetto della concentrazione del sale sull’enzima è stata valutata usando diversi tipi di sali inorganici a concentrazioni diverse. L’enzima ha mostrato un’attività dipendente dalla concentrazione di sale, in particolare è risultato totalmente inattivo in assenza di sale, raggiungendo, invece, l’attività ottimale a concentrazioni molari di sale. Nonostante le particolari condizioni richieste dall’enzima per essere attivo, abbiamo indagato sulla possibilità di utilizzarlo come biocatalizzatore per convertire substrati chetonici in esteri. L’ostacolo principale che abbiamo dovuto affrontare è stata proprio l’aloficità di questo enzima e la necessità di dover accoppiare la sua attività a un enzima di rigenerazione del cofattore proveniente da un organismo mesofilo. Abbiamo testato l’attività residua di entrambi gli enzimi a diverse concentrazioni di NaCl e abbiamo scelto di condurre le bioconversioni in 1M NaCl. In queste condizioni entrambi gli enzimi sono risultati stabili e tutti i substrati testati sono stati completamente convertiti. Poiché il sale ad alte concentrazioni riduce l’attività dell’acqua, gli enzimi alofili sono considerati avere potenziali applicazioni in processi biocatalitici in ambienti con una bassa attività dell’acqua, come le miscele di acqua e solvente organico. Le potenzialità di Ht-BVMO, come biocatalizzatore in miscele organiche, sono state esplorate saggiandone l’attività residua in presenza di diversi solventi organici. I risultati hanno mostrato che le alte concentrazioni di sale, necessarie a mantenere l’attività enzimatica, possono essere parzialmente sostituite dai solventi organici. Questo nuovo enzima, oltre ad ampliare il pannello delle Baeyer-Villiger monoossigenasi disponibili, mostra delle peculiari proprietà biochimiche e una tolleranza ai solventi organici che lo rendono particolarmente interessante per applicazioni biotecnologiche. 1.2 Capitolo II Le Baeyer-Villiger monoossigenasi sono enzimi che sono stati identificati in batteri e funghi e la maggior parte di essi è coinvolta in vie cataboliche per la degradazione di molecole organiche. Recentemente sono state identificate ed espresse in forma ricombinante due nuove BVMOs da un’alga rossa acidofila, Cyanidioschyzon merolae, e da il muschio Physcomitrella patens. Queste due proteine sono le prime Baeyer-Villiger monoossigenasi che sono state identificate in organismi fotosintetici. L’attività catalitica di questi enzimi è stata testata su una vasta gamma di substrati. Gli enzimi hanno mostrato preferenza per substrati chetonici con lunga catena alifatica, tuttavia l’attività catalitica è risultata piuttosto bassa. Per studiare la funzione fisiologica di questi nuovi enzimi, finora inesplorati in organismi fotosintetici, e per indagare ulteriormente sulle loro potenzialità biocatalitiche, siamo interessati a scoprire il loro substrato naturale. La loro attività su substrati chetonici a lunga catena alifatica, già verificata in vitro, ci ha fatto ipotizzare un loro coinvolgimento nelle vie degradative o di sintesi dei pigmenti fotosintetici. Con questo scopo, abbiamo deciso di adottare un approccio di “reverse genetic”. Physcomitrella patens e Cyanidioschyzon merolae sono organismi soggetti a ricombinazione omologa. In particolare, Physcomitrella patens è un organismo modello per il quale le tecniche di “gene targeting” sono state ampiamente sviluppate e applicate per studi evolutivi sulle piante. Siamo stati in grado di ottenere mutanti knock-out per il gene codificante la Baeyer-Villiger monoossigenasi in Physcomitrella, ma non sono stati identificati fenotipi associati a questi mutanti. Per verificare il possibile coinvolgimento di questo enzima nella sintesi o degradazione dei pigmenti fotosintetici, abbiamo confrontato il profillo cromatografico dei pigmenti estratti da un organismo “wild-type” e dai mutanti Knock-out, ma non è stata osservata alcuna variazione significativa nella composizione dell’estratto. Cyanidioschyzon merolae, invece, è un’alga rossa acidofila unicellulare il cui genoma nucleare e plastidiale è stato recentemente sequenziato. Abbiamo progettato di produrre un’alga knock-out per la BVMO revertendo la prototroficità in un mutante di Cyanidioschyzon merolae (chiamato M4) che mostra auxotrofia per l’uracile. Usando Il mutante M4 come ricevente, abbiamo tentato di interrompere la sequenza codificante la BVMO usando un costrutto composto da il gene wild type URA 5.3 (codificante l’orotidina 5’-monofosfato decarbossilasi in C.merolae) fiancheggiato dalle sequenze al 5’ e 3’ della regione codificante la BVMO. Sebbene tecniche di “gene targeting” siano state applicate [95], metodi e strumenti per la modificazione genetica e la coltivazione in condizioni di laboratorio devono ancora essere ottimizzati per questo organismo. Sebbene siamo stati in grado di crescere l’organismo sia in terreno liquido che solido, tutti i tentativi di ottenere transformanti sono risultati vani. 1.3 Capitolo III Le CCDs (carotenoid cleavage dioxygenases) sono enzimi che catalizzano il taglio di un doppio legame carbonio-carbonio in molecole organiche. La possibilità di utilizzare questi enzimi per applicazioni biocatalitiche ha suscitato l’interesse di numerose aziende chimiche. Diversamente da altri enzimi che tagliano il doppio legame C-C (come le perossidasi), le CCDs sono caratterizzate da un’alta regioselettività e la loro attività catalitica non porta a prodotti secondari. La maggior parte delle CCDs accetta come substrati un’ampia gamma di carotenoidi, ma la loro attività catalitica è selettiva nei confronti della posizione del doppio legame nel carotenoide. Lo scopo iniziale del progetto era quello di valutare l’attività in vitro di CsZCD, l’enzima identificato come responsabile dell’attività di taglio della zeaxantina alla posizione 7, 8 (7’, 8’) in Crocus sativus [119]. La riproducibilità dei dati ottenuti dalla caratterizzazione biochimica di CsZCD è oggetto di discussione [124,125], e più recentemente, nel 2014, una nuova carotenoid cleavage dioxygenase, CsCCD2, è stata identificata come responsabile del del taglio ossidativo del doppio legame della zeaxantina alla posizione 7-8 (7’-8’) in Crocus sativus [120]. In questo progetto abbiamo cercato di caratterizzare gli enzimi ZCD e CCD2 con lo scopo di indagare sul loro potenziale di enzimi utili a processi biocatalitici. Le forme ricombinanti di queste proteine sono state fuse a glutatione s-transferasi o a tioredossina per aumentarne la solubilità e facilitarne la purificazione. Sebbene entrambi gli enzimi siano stati altamente espressi in E.coli, la loro purificazione ha portato a rese molto basse. L’attività delle proteine purificate e del lisato cellulare di E. coli contenente gli enzimi di interesse è stata testata in vitro. Il saggio enzimatico è stato condotto sul substrato naturale di questo enzima, la zeaxantina, e i risultati sono stati analizzati con cromatografia HPLC. I profili cromatografici delle reazioni non hanno rilevato la formazione dei prodotti di taglio, il 3-OH-β-apo-8’-carotenale e la crocetina dialdeide, perciò non è stata osservata alcuna attività catalitica per gli enzimi purificati. I risultati portano a concludere che gli enzimi prodotti siano inattivi, probabilmente a causa di uno scorretto ripiegamento durante l’espressione, che ha portato a una struttura terziaria non funzionale all’attività enzimatica.