"Retinal Disorders: advanced methods for the genetic diagnosis and genotype-phenotype correlations"

Riassunto Presupposti dello studio: Secondo l’organizzazione mondiale della sanità, 39 milioni di persone sono ciechi. Tra principali cause genetiche che inducono compromissione visiva, con una prevalenza di 1:2500-4000, le Distrofie Retiniche Ereditarie (i.e. Inherited Retinal Dystrophy - IRD), la Distrofia Maculare Occulta (OMD) e la Degenerazione Maculare legate all’Età (AMD) sono le più diffuse. Le prime sono un gruppo di patologie che inducono degenerazioni retiniche indotte da mutazione in almeno 280 geni e molti loci. Le forme di IRD possono essere sindromiche o non sindromiche, sporadiche o ereditarie, con tutti i pattern di eredità possibili. Infatti, oltre alle forme autosomiche dominati e recessive e le forme legate al cromosoma X, sono possibili forme sporadiche, digeniche e mitocondriali. Una delle principali caratteristiche di queste patologie è la loro elevata eterogeneità, legata all’elevato numero di geni e di mutazioni coinvolti. Questi geni, infatti, codificano proteine coinvolte nei processi di foto-trasduzione e del ciclo visivo, espressi principalmente nelle cellule dell’epitelio pigmentato retinico o nei fotorecettori. Queste malattie hanno un andamento progressivo che inizia, generalmente, con difficoltà nella visione notturna, perdita della visione periferica e fotofobia, fino alla cecità assoluta. Oltre alla eterogeneità genetica, queste patologie sono caratterizzate da eterogeneità allelica e clinica, che rendono complessa la diagnosi clinica ed anche le correlazioni genotipo-fenotipo, qualora si conosca la causa genetica del paziente. Se l‘eterogeneità genetica è determinata dalla presenza di differenti mutazioni che inducono la stessa manifestazione clinica, l’eterogeneità clinica (o allelica) si ha in presenza di mutazioni sullo stesso gene che causano fenotipi differenti. Mentre la Degenerazione Maculare Occulta è una distrofia maculare ereditaria causata da mutazioni nel gene RP1L1, con una trasmissione autosomica dominate, la Degenerazione Maculare legata all’Età è una patologia complessa causata dall’associazione di fattori genetici, ambientali e dall’età avanzata. Attualmente per queste patologie non sono disponibili né test diagnostici né cure. Scopo dello studio: L’obiettivo di questo progetto è lo sviluppo di test diagnostici validi per la caratterizzazione genetica dei pazienti affetti da IRD o OMD. Per tale scopo, 620 pazienti e familiari affetti sono stati clinicamente caratterizzati e dalla collezione dei loro DNA è stata creata una biobanca genetica disponibile per eventuali test genetici. In base alla patologia di cui sono affetti, i test diagnostici sono stati eseguiti mediante utilizzo di Sanger sequencing o Next Generation Sequencing (NGS) al seguito del quale sono stati realizzate delle correlazioni tra il genotipo e il fenotipo. Materiali e metodi: Dopo anamnesi clinica e approfondito esame visivo, i pazienti sono stati sottoposti a prelievo di sangue da cui è stato estratto il DNA stoccato all’interno della biobanca. In parallelo una biobanca retinica è stata generata dalla collezione di retine di domatori, raccolte in accordo alle normative vigenti. Lo screening genetico è stato eseguito su 190 pazienti affetti da differenti forme autosomiche recessive o dominanti di IRD, mediante la tecnologia targeted NGS, con pannelli di 25 geni. Dopo la selezione delle varianti o mutazioni identificate dall’analisi, è stato eseguito il sequenziamento Sanger per la loro conferma. La corretta attribuzione dei risultati agli individui analizzati è stata realizzata grazie alla comparazione di profili genetici ottenuti dal DNA della biobanca e quello residuo dall’analisi NGS. Lo screening genetico, dei pazienti affetti da forme X-linked di IRD (n=60) o da OMD (n=5) è stato ottenuto da sequenziamento Sanger dei geni RPGR e RP2 (IRD) o RP1L1 (OMD). Un test di suscettibilità genetica è stato sviluppato e applicato a 118 pazienti (39 dei quali precedentemente screenati con NGS), mediante real time PCR, per valutare l’espressione di 7 polimorfismi associati all’AMD nei soggetti affetti da IRD. Risultati: Con lo screening NGS 256 varianti/mutazioni sono state identificate in 126 pazienti. Tra queste il 49% è rappresentato da alterazioni non note in letteratura. I geni maggiormente mutati sono USH2A (15%) e ABCA4 (14%), mentre nessuna alterazione è stata riscontrata nei geni BEST1, CRX, LRAT and RLBP1. Il 27% dei casi è stato completamente risolto, mentre il 39% solo parzialmente, a causa dell’identificazioni di una sola mutazione recessiva o di varianti di significato incerto. Le varianti missenso coprono l'80% del totale, seguite dalle mutazioni nonsenso (9%), dalle inserzioni/delezioni frameshift (8%), dalle inserzioni/delezioni in-frame (2%) e dalle alterazioni di splicing (1%). La correlazione del genotipo identificato con il fenotipo diagnosticato è stata possibile in quasi la metà dei pazienti geneticamente caratterizzati. Dalla comparazione è stato possibile identificare forme trialleliche, con la mutazione missenso G1961E di ABCA4 come allele aggravante, e una nuova associazione gene-malattia per il gene PRPF31 che in tre pazienti causa la sindrome di Usher. L’analisi dei probandi affetti da forme X-linked di Retinite Pigmentosa ha permesso l’identificazione di un’inserzione framshift nell’ORF15 del gene RPGR, una mutazione nonsenso in RPGR gene e una mutazione missenso nota in RP2, in tre famiglie distinte. Tra i pazienti affetti da OMD, è stata identificato per due di essi la mutazione missenso S1199F in RP1L1. Il test di suscettibilità per i 7 SNP ha evidenziato un elevato alto genetico di AMD in 38 soggetti, medio alto in 16, medio in 36, e basso in 28. Conclusioni: La tecnologia NGS si è rivelata un utile strumento diagnostico per le forme autosomiche dominanti o recessive di distrofie retiniche, permettendo il sequenziamento massivo e parallelo di molti geni e pazienti. La percentuale di pazienti geneticamente caratterizzati è coerente con i dati presenti in letteratura. L’uso di un pannello di geni risulta essere un accettabile compromesso tra la i risultati ottenuti e le criticità legate alla grande quantità di dati output, rispetto alle analisi di whole genome o whole exome sequencing. Buona parte dei dati genetici sono stati correlati alle manifestazioni cliniche dei pazienti. La tecnologia Sanger, gold standard del sequenziamento, è ottimale per l’identificazione della causa genetica in tutte le patologie ove uno o pochi geni sono coinvolti, come le forme X-linked di IRD o la OMD. L’espressione di fattori di rischio, predisponenti alla degenerazione maculare, pur non correlando con la severità delle mutazioni confermate, potrebbe fornire importanti relazioni con le patologie di cui i soggetti sono affetti. L'identificazione delle cause genetiche di queste patologie porterà una nuova spinta nello sviluppo di nuove terapie geniche e cellulari, fondamentali per il trattamento delle patologie retiniche ereditarie.