Mass Spectrometry-Based Quantitative Proteomics to Study Proteomes, Phosphoproteomes and Interactomes

Negli ultimi anni, la ricerca proteomica basata sulla spettrometria di massa è stata applicata in modo esponenziale ai più diversi campi della biochimica, biomedicina e biologia, permettendo il parallelo sviluppo di nuovi approcci per la quantificazione relativa e assoluta delle proteine. Nel corso del mio dottorato, ho seguito lo sviluppo di tre progetti principali, sfruttando diverse tecniche di spettrometria quantitativa. In particolare, le tecnologie SILAC e iTRAQ sono state applicate allo studio del processo di calcificazione delle cellule interstiziali delle valvole aortiche, mentre i metodi SILAC e di quantificazione label-free sono stati sfruttati per l’identificazione di potenziali interattori e substrati della protein chinasi CK2. La calcificazione delle valvole aortiche è una delle più comuni patologie valvolari e prima causa di sostituzione valvolare nei paesi industrializzati. A oggi sfortunatamente non esistono terapie che possano prevenire o curare la deposizione di calcio nelle valvole aortiche, e l’unica soluzione è l’intervento chirurgico. Per chiarire le basi molecolari di questo processo, abbiamo applicato le metodiche SILAC e iTRAQ ad un modello cellulare basato su cellule valvolari cardiache bovine (BVIC), in grado di acquisire un profilo pro-calcifico e favorire la mineralizzazione della matrice extra-cellulare in risposta ad uno stimolo infiammatorio come l’endotossina lipopolisaccaride (LPS). L’utilizzo di due diverse tecnologie allo stesso modello cellulare ha permesso l’identificazione, e la relativa quantificazione, di centinaia di proteine, parecchie delle quali mostrano una significativa alterazione in risposta al trattamento con LPS. L’analisi dei dati ha infatti rivelato l’alterazione di proteine appartenenti a diversi processi cellulari, quali la regolazione del citoscheletro, dei meccanismi ossidoriduttivi e dello spliceosoma, la via metabolica della glicolisi/gluconeogenesi, e il metabolismo dell’arginina, suggerendo il coinvolgimento di queste vie nel fenomeno della calcificazione delle valvole aortiche. Questi risultati rappresentano perciò un punto di partenza per nuovi dettagliati studi dei meccanismi molecolari alla base della calcificazione valvolare indotta da LPS. Gli altri progetti descritti in questa tesi sono focalizzato su CK2, una protein chinasi essenziale, altamente pleiotroica e costitutivamente attiva, fortemente implicata in una moltitudine di processi cellulari, in particolare nella trasduzione dei segnali di sopravvivenza, per la quale sembra giocare un ruolo chiave. Tuttavia una completa comprensione del ruolo che CK2 ricopre nei vari processi cellulari in cui è implicata non è ancora stata raggiunta, perciò questo lavoro ha come scopo l’identificazione di nuovi potenziali interattori e substrati di CK2, allo scopo di chiarire maggiormente la sua funzione all’interno della cellula. Nello specifico, abbiamo abbinato esperimenti d’immunoprecipitazione e analisi quantitativa label-free per lo studio delle proteine che interagiscono con CK2, mentre la tecnologia SILAC combinata con l’uso di un inibitore potente e specifico di CK2 è stata applicata alla ricerca di nuovi potenziali substrati di questa chinasi direttamente in un sistema cellulare. I risultati ottenuti confermano le conoscenze già note riguardo al coinvolgimento di CK2 in diversi processi essenziali per la vita cellulare, e fanno emergere chiaramente un coinvolgimento di primo piano di CK2 nei processi di biosintesi e degradazione proteica. Inoltre, l’analisi dei dati ha anche rivelato interessanti ed inattesi aspetti del turnover di fosforilazione/defosforilazione di proteine fosforilate da CK2. I dati ottenuti sono dettagliatamente presentati in questa tesi, da un punto di vista sia tecnico che biologico. Infine, durante il dottorato ho anche collaborato alla realizzazione di un progetto volto all’identificazione di bersagli molecolari nella terapia fotodinamica antimicrobica, utilizzando un approccio proteomico. Da questa collaborazione, è nato un lavoro (non descritto in questa tesi) che è stato recentemente sottoposto a “Journal of Proteomics” con il titolo: “Molecular Targets of Antimicrobial Photodynamic Therapy Identified by a Proteomic Approach”.