The role of specific serum/plasma proteins in the modulation of the cellular response to amorphous silica nanoparticles

Le nanoparticelle sono strutture di diverse dimensioni (1-100 nm) e varia composizione (ossidi metallici, polimeri di silice, polimeri di acidi organici), presenti nell’ambiente come conseguenza di processi naturali (eruzioni vulcaniche, erosione di rocce) o antropogenici (inquinamento, attività industriale). Negli ultimi decenni esse sono state intensamente studiate e ingegnerizzate a scopo industriale (come additivi di cibi, cosmetici e materiali utilizzati nell’edilizia) e nell’ambito biomedico, in cui possono essere impiegate come vettori per farmaci o agenti di imaging. Grazie alla sua abbondanza, economicità e resistenza, il biossido di silicio (SiO2) è, nella sua forma amorfa, uno dei materiali maggiormente usati sia in ambito industriale che biomedico (contrariamente alla forma cristallina che provoca l’insorgenza della silicosi, una malattia polmonare cronica molto diffusa nei minatori, lavoratori di ceramica e altre categorie occupazionali quotidianamente esposte a cristalli/fibre di silicio). Nonostante la silice amorfa sia considerata molto meno pericolosa di quella cristallina, studi recenti condotti in vitro e su modelli animali hanno messo in luce un potenziale citotossico e pro infiammatorio. Per chiarificare questo aspetto, nella prima parte del mio dottorato ho caratterizzato la citotossicità e l’induzione di una risposta pro infiammatoria di nanoparticelle di silice amorfa (la variante commerciale non fluorescente Ludox TM40 e la variante fluorescente Stöber) su due modelli di cellula fagocitica (monociti e macrofagi primari umani) e in due modelli di cellula non fagocitica (linfociti primari umani e la linea stabile epiteliale HeLa). In particolare, mi sono concentrata sui possibili meccanismi coinvolti nell’azione delle nanoparticelle e su come il siero possa influenzarli. Un primo risultato ha indicato una maggior tossicità delle nanoparticelle di silice (valutata in termini di disfunzione mitocondriale e permeabilizzazione della membrana) nelle cellule fagocitiche, associata anche alla produzione delle tre principali citochine pro infiammatorie (IL-1beta, TNF-alfa and IL-6). Più in dettaglio, la dose di nanoparticelle in grado di uccidere il 50% delle cellule (LD50) dopo un trattamento di 18 h è risultata essere di 40 µg/ml, mentre le cellule non fagocitiche hanno mostrato una maggior resistenza alle nanoparticelle (LD50 300-500 µg/ml). Analizzando il tipo di morte indotta dalle nanoparticelle di silice, le cellule HeLa hanno mostrato un fenotipo apoptotico, mentre i monociti, macrofagi e linfociti sono risultati andare incontro a necrosi. Da una valutazione al citofluorimetro e al microscopio confocale dell’associazione e della localizzazione cellulare delle nanoparticelle è emerso che queste venivano internalizzate in compartimenti acidi nelle due cellule fagocitiche, mentre nelle cellule HeLa rimanevano legate alla membrana plasmatica. Questo risultato ha suggerito che la maggior sensibilità dei fagociti fosse dovuta a una maggior captazione delle nanoparticelle che, una volta accumulate all’interno di endo-lisosomi, potessero provocarne la rottura con la conseguente liberazione di enzimi litici (proteasi, idrolasi, lipasi) in grado di danneggiare la cellula. A questo proposito, è stato valutato il contributo dell’ambiente acido degli endo-lisosomi alla tossicità delle nanoparticelle di silice nei fagociti trattando le cellule in presenza o in assenza di due agenti neutralizzanti (NH4Cl o Bafilomicina AI), ottenendo una diminuzione della citotossicità della silice nei monociti e solo un lieve effetto nei macrofagi. Come anticipato precedentemente, le nanoparticelle di silice si sono mostrate in grado di indurre una risposta infiammatoria (più evidente nei monociti) caratterizzata da un’iniziale fase di latenza fino al raggiungimento della soglia di tossicità, un picco centrale e una fase finale decrescente (in corrispondenza delle dosi più alte di nanoparticelle) a causa della forte e anticipata morte cellulare. In particolare, l’ IL-1beta è risultata essere la citochina prodotta più abbondantemente, seguita dal TNF-alfa e dall’IL-6; inoltre, in copresenza di nanoparticelle e LPS essa veniva secreta in modo sinergico. Dal momento che la silice cristallina è in grado di attivare l’inflammasoma NLRP3 (un complesso multi proteico citosolico responsabile della produzione di alcune citochine pro infiammatorie, prima fra tutte l’ IL-1beta una parte del lavoro di tesi è stata dedicata allo studio dell’attivazione di NLRP3 da parte di nanoparticelle di silice amorfa nei nostri due modelli di cellula fagocitica. Inizialmente è stata evidenziata sia in monociti che in macrofagi la capacità delle nanoparticelle di silice amorfa di aumentare i livelli di pro IL1-beta e stimolarne la conversione nella forma matura IL-1beta tramite un processo dipendente dall’attivazione della caspasi 1, della secrezione di ATP ed dal successivo legame di ATP al suo recettore P2X7. Inoltre, a seguito del blocco di P2X7 con uno specifico inibitore la mortalità indotta dalle nanoparticelle di silice non ha subito variazioni sia nei monociti che nei macrofagi, mentre i monociti hanno mostrato una maggior resistenza alle nanoparticelle in presenza di un inibitore della caspasi 1, segno di una possibile morte per piroptosi causata dalle nanoparticelle in queste cellule. Un altro aspetto importante presentato in questa tesi di dottorato riguarda l’influenza del siero (FCS) sugli effetti citotossici e pro infiammatori indotti dalle nanoparticelle di silice amorfa. Innanzitutto, all’aumentare della concentrazione del siero sia la soglia di tossicità sia l’LD50 delle nanoparticelle di silice sono risultate spostate verso valori più alti, indicando un effetto protettivo dell’ FCS (più evidente nei non fagociti rispetto ai fagociti), cosi come la produzione di citochine pro infiammatorie nei monociti e nei macrofagi. Per capire se questo spostamento fosse dovuto a una diversa associazione delle nanoparticelle alle cellule sono stati fatti esperimenti con le nanoparticelle fluorescenti Stöber, che hanno evidenziato come la presenza di siero fosse in grado di diminuire il legame fra la nanoparticelle e le cellule, in particolare nel caso dei linfociti e delle HeLa. Questo risultato è in accordo con la precedente osservazione di un maggior effetto protettivo del siero nei non fagociti, e rafforza l’ipotesi che la tossicità delle nanoparticelle sia in qualche modo legata al loro livello di interazione con le cellule. Inoltre, anche la localizzazione intracellulare delle nanoparticelle è risultata essere influenzata dalla concentrazione di siero. In particolare, in assenza di siero le nanoparticelle erano prevalentemente distribuite sulla membrana cellulare nei monociti e nelle HeLa, mentre nei macrofagi venivano internalizzate in fago-lisosomi, anche se meno efficientemente che con 10% FCS. Vista la diversa localizzazione subcellulare nelle due diverse condizioni di siero, ci si è chiesti se l’effetto protettivo dell’ NH4CL, Bafilomicina AI e dell’inibitore della caspasi 1 osservato nei monociti nelle condizioni di coltura standard (10% FCS) venisse mantenuto anche in assenza di siero. Né la neutralizzazione dei compartimenti acidi né l’inibizione della caspasi 1 si sono dimostrati efficaci nel prevenire la tossicità, indicando che nei monociti il meccanismo di morte cellulare fosse diverso in assenza o in presenza di siero. Nella seconda parte della mia tesi di dottorato ho analizzato diversi aspetti dell’interazione delle nanoparticelle con le proteine del plasma e del siero, essendo questo un aspetto cruciale nell’applicazione dei nanomateriali in campo biomedico. Infatti, nanoparticelle introdotte nell’organismo (in particolare del circolo sanguigno come vettori per farmaci o agenti d’immagine) vengono rapidamente rivestite da una serie di proteine (costituenti la cosiddetta “corona di proteine”) in grado di mediare l’interazione cellula-nanoparticella. Questa problematica è stata affrontata utilizzando come nanoparticelle modello le Ludox TM40 (per mantenere la continuità con la caratterizzazione fatta in precedenza) ed eseguendo esperimenti in parallelo con il siero fetale bovino ed il plasma umano. Le principali proteine del siero bovino legate alle nanoparticelle di silice sono risultate essere il plasminogeno, l’albumina, le apolipoproteine AI e AII e l’emoglobina, mentre quelle del plasma umano le immunoglobuline, l’histidine rich glycoprotein, l’albumina e le apolipoproteine AI, AII e CIII. Il pattern di proteine adsorbite alle nanoparticelle di silice ha evidenziato che a basse concentrazioni di siero/plasma la principale proteina legata era l’albumina (la proteina più abbondante del siero/plasma), mentre all’aumentare della concentrazione di siero/plasma essa veniva “spiazzata” da proteine meno abbondanti (in primis dalle apolipoproteine), suggerendo una maggiore affinità di queste ultime per la superficie di nanoparticelle di silice amorfa. In accordo con questa ipotesi, le nanoparticelle inizialmente legavano il plasminogeno, l’emoglobina e le apolipoproteine, mentre solo quando queste proteine venivano esaurite dal siero (in presenza di alte dosi di nanoparticelle) iniziava a legarsi l’albumina, proporzionalmente alla quantità di nanoparticelle presenti. Dall’analisi del pattern di proteine legate alla silice in presenza di differenti pH è emerso che esso non subiva variazioni rilevanti in presenza di un ambiente neutro (rappresentativo del citoplasma) o di un ambiente acido (rappresentativo degli endo-lisosomi). Infine, esperimenti preliminari su come le singole proteine della corona potessero influenzare l’attività biologica delle nanoparticelle hanno indicato né le immunoglobuline né l’HRG erano in grado di diminuire gli effetti citotossici delle nanoparticelle, mentre l’albumina e, in particolare, le HDL erano fortemente protettive, riducendo l’associazione delle nanoparticelle alle cellule